Giới thiệu về PMI - Phương pháp chọn lọc mô sau kh- 123docz.net

IV. Phương pháp chọn lọc mô sau khi chuyển gen bằng gen pmi

1. Giới thiệu về PMI

Quá trình chuyển gen trên lúa thông qua việc chọn lọc bằng kháng sinh và thuốc diệt cỏ ựã ựạt nhiều thành tựu, nhưng vẫn có nhiều lo lắng rằng các gen marker có thể bị chuyển sang các vi sinh vật và từ ựó gia tăng số lượng của các nguồn gây bệnh có khả năng kháng thuốc hoặc từ sự chuyển marker ựó sang những dòng họ hoang dại có thể từ ựó sẽ truyền sang các loại dịch hại trên loài hoang dại ựó (Dale, 1992; Nap và ctv, 1992). Và trong suốt quá trình chọn lọc, phần lớn các mô ựược nuôi cấy sẽ bị chết. Nhưng mô chết này có thể phóng thắch ra ựộc chất (như phenolics), những chất này có thể từ từ làm suy yếu ựi sự phát triển của mô ựược chuyển gen. Thêm nữa, nhưng mô ựã chết này có thể trở thành rào cản giữa môi trường nuôi cấy với mô ựã ựược chuyển gen, từ ựó ngăn cản hoặc làm chậm lại quá trình hấp thu các dưỡng chất thiết yếu từ môi trường nuôi cấy (Joersbo và Okkels, 1996). Ngoài ra hệ thống chọn lọc dựa trên các chất kháng sinh và thuốc diệt cỏ cũng cho phép sự phát triển của các gen không ựược chuyển gen, ngay cả trong môi trường chọn lọc có nồng ựộ cao, và ựộc hại cho sự tái sinh chồi.

Vì thế sau ựó, việc tạo ra cây trồng chuyển gen nhằm tránh việc sử dụng các ựộc chất thì ựược ựánh giá là có nhiều hứa hẹn (WHO, 1993; Daniell, 1999; Malik và Saroha, 1992). Một số kỹ thuật mới ựược phát triển nhằm loại bỏ các gen marker ựể giải quyết vấn ựề nói trên. Một loại vecter nhị hợp mới có chứa hai ựoạn T-DNA khác nhau ựược sử dụng ựể chuyển gen trên lúa và ựiểm khác

biệt của việc chuyển gen trên các phép thế hệ cây chuyển gen sau cho phép sự phát sinh của các cây chuyển gen mà không cần marker (Komari và ctv, 1996).

Gần ựây, một hệ thống chọn lọc mới ựược phát triển cho phép quá trình chọn lọc các mô ựã ựược chuyển gen bằng sự trợ giúp của ựường, ựó là loại ựường nào mà không thể ựược chuyển hóa và sử dụng bởi những tế bào thực vật không ựược chuyển gen. Có một số bài báo cáo rằng gen xylose isomerase từ vi khuẩn Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes ựã ựạt hiệu quả cao trong việc chọn lọc các mô của cây trồng ựược chuyển gen như cà chua, thuốc lá, khoai tây và sử dụng D-xylose như là một nhân tố chọn lọc (Huldrup và ctv, 1996, 1998a, b). Các tế bào ựã ựược chuyển gen ựó có thể sử dụng xylose như một nguồn carbon và giúp tăng nhanh số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy, trong khi những tế bào không ựược chuyển gen sẽ bị thiếu dưỡng chất và chết dần. Cách chọn lọc này không giết chết các mô không ựược chuyển gen, nhưng nó ựem ựến cho các mô ựược chuyển gen một thuận lợi rõ ràng. Một phương pháp chọn lọc khác tương tự dựa vào gen phosphomannose isomerase (PMI) có nguồn gốc từ Escherichia coli (Miles và Guest, 1984) ựược sử dụng như một gen chọn lọc và mannose là một nhân tố chọn lọc. Mannose sẽ ựược chuyển hóa thành mannose-6-phosphate, chỉ những mô ựã ựược chuyển gen PMI mới có khả năng chuyển hóa mannose-6-phosphate thành fructose-6-phosphate, trong khi những mô không ựược chuyển gen sẽ bị tắch lũy mannose-6-phosphate trong tế bào và ựi kèm với việc tiêu thụ nguồn phosphate và ATP trong tế bào. Sự phosphoryl hóa mannose sẽ dẩn ựến việc ngăn cản quá trình phát triển chồi của mô (Pego và ctv, 1999) và dẩn ựến sự suy yếu của mô trong suốt quá trình nẩy chồi (Wang và ctv, 2000).

2. Một số ứng dụng của phương pháp chọn lọc bằng mannose

a) Lúa

Phương pháp chọn lọc bằng mannose ựược thực hiện trên giống lúa Taipei 309 theo công trình nghiên cứu của Paola Lucca và ctv (2000). Mô sẹo từ phôi lúa sẽ ựược chủng với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thuộc dòng

LBA4404 (Hoekema và ctv, 1984). Sau khi ựồng nuôi cấy 3 ngày thì mô sẹo sẽ ựược ựưa vào môi trường Recover với 3% sucrose và 250mg/l cefotaxime trong vòng 1 tuần. Sau một tuần thì ta tiến hành chọn lọc qua ba môi trường có chứa mannose, mô sẹo sẽ ựược chuyển môi trường sau mỗi hai tuần, nồng ựộ mannose và sucrose của từng môi trường như sau:

o Môi trường chọn lọc thứ nhất: 3% mannose và 3% sucrose

o Môi trường chọn lọc thứ hai: 3% mannose và 1,5% sucrose

o Môi trường chọn lọc thứ ba: 5% mannose và 0,5% sucrose.

Tất cả các môi trường chọn lọc ựều chứa 250mg/l cefotaxime ựể hạn chế sự nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chọn lọc này ựược ựể trong tối với nhiệt ựộ khoảng 290C, kết quả của nghiên cứu cho thấy hiệu quả chuyển gen bằng phương pháp chọn lọc này trên lúa có thể ựạt ựến 41%.

b) Cây lúa miến

Trong plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng ựể chuyển gen sẽ có chứa cùng lúc 2 loại marker khác nhau ựó là gen chọn lọc pmi và gen chuyển ựó là sgfp (Zhensheng Gao và ctv, 2005). Cả hai gen ựược ựiều khiển bởi promote ubi 1 trong vector nhị phân pPZP201. Mô sẹo của phôi sẽ ựược cho phát triển trên môi trường chứa từ 1-2% mannose. Quá trình chọn lọc ựược thực hiện như sau:

o Sau khi chuyển gen, mô sẹo sẽ ựược chuyển môi trường mỗi tuần một lần trong môi trường chứa 1,5-2,0% mannose, và chọn lọc trong vòng 4-6 tuần trong tối.

o Và sau ựó mô sẽ ựược nuôi cấy trong môi trường chứa 1,0-1,5% mannose và có ánh sáng chiếu vào trong vòng 2 tuần, ở bước này thì những mô không ựược chuyển gen sẽ phát triển chậm lại và thậm chắ có thể chết.

o Sau hai tuần tiếp tục chuyển sang môi trường mới chứa 3% mannose và 2% sucrose, và cũng nuôi cấy trong vòng hai tuần.

o Môi trường chọn lọc cuối cùng chỉ chứa 1,0% mannose.

Ở phương pháp này cho thấy hiệu quả chuyển gen có thể ựược nâng cao lên khoảng 2,88-3,3% (Zhensheng Gao và csv, 2005), cao hơn so với những bài báo cáo trước ựây về chuyển gen trên cây lúa miến.

c) Cây cam

Hiệu quả của việc sử dụng phương pháp chọn lọc bằng mannose cũng ựược nghiên cứu trên cây cam ngọt (Citrus sinensis L. Osbeck), mô sẽ ựược chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 101-pNOV2116 và ựược chọn lọc lần lượt trên môi trường có nồng ựộ mannose khác nhau và sử cả mannose và sucrose như nguồn carbon cho cây phát triển(R. L. Boscariol và ctv, 2003). Hạt sẽ trải qua quá trình nuôi cấy tạo phôi trong khoảng 4 tuần sau ựó sẽ chọn ra những mô tốt ựể tiến hành chuyển gen. Mô sau khi ựồng nuôi cấy trong 3 ngày thì sẽ ựược chọn lọc trên môi trường chứa từ 73mM ựến 112,3mM và cefotaxime(500mg/l). Kết quả của công trình nghiên cứu này cho thấy hiệu quả chuyển gen trên cây cam ngọt có thể ựạt từ 3% ựến 23,8% tùy vào cây.

d) Táo

được nghiên cứu bởi Juliana Degenhardt và các cộng sự (2006). Mô sẹo ựược nuôi lá của cây táo, mô ựược chủng với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thuộc dòng LBA4404 và plasmind ựược sử dụng là plasmid pNOV2819. Mô ựược nuôi cấy trong môi trường chọn lọc có sự kết hợp của mannose và sorbitol. Các môi trường chọn lọc sẽ có nồng ựộ mannose tăng dần (0,2,5 và 10g/l) trong khi nồng ựộ sorbitol sẽ giảm dần (30,15,10,5g/l). Và hiệu quả thành công của sự chuyển gen ựạt từ 1,4-3%.

Ngoài ra chọn lọc mô ựã ựược chuyển gen bằng phương pháp chọn lọc mannose còn ựược ứng dụng ở nhiều loại cây khác nhau như ở khoai tây (Solanum tuberosum L.), củ cải ựường (Beta vulgaris L.), và bắp (Zea mays L.) (Bojsen và ctv, 1999); Arabidopsis (Arabidopsis thalianaL.) (Todd và Tague, 2001); cây sắn (Manihot esculenta Crantz) (Zhang và ctv, 2000); bắp (Negrotto và ctv, 2000;Wang và ctv, 2000; Wright và ctv, 2001), gạo (Oryza sativa L.)

(Datta và ctv, 2003; He và ctv, 2004; Hoa và ctv, 2003; Lucca và ctv, 2001); củ cải ựường (Joersbo và ctv, 1998, 1999); củ cải ựường (Triticum aestivum L.) (Wright và ctv, 2001); ựu ựủ (Zhu và ctv, 2005); dưa leo (He và ctv, 2006), quả hạnh nhân (Ramesh và ctv, 2006), lúa mạch (Reed và ctv, 2001).

3. Sự chuyển hóa mannose trong cơ thể

Mannose là một loại ựường ựơn và có liên quan mật thiết ựến các chu trình chuyển vật chất trong cơ thể, nó thường ở dạng kết hợp trong các glycoprotein và glycolipids hoặc ở dạng focose và sau ựó cũng nằm trong liên kết với các protein ựể tạo thành glycoprotein. Nguồn gốc của ựường mannose chắnh là ựường glucose. Mannose là dạng ựường tự do có trong một số loại trái cây như ựào, táo, và camẦnhưng chỉ ựược hấp thụ chỉ khoảng 12% so sự hấp thu gluco trong dạ dày ruột của chuột (Deuel và ctv, 1939). Mannose có thể ựược phóng thắch từ glycoprotein và glycolipid bởi hoạt ựộng của mannosidase trong dạ dày ruột nhưng các thông tin về quá trình này vẫn còn rất ắt. đường mannose và fucose ựược tìm thấy ở nhiều dạng khác nhau của glycoprotein. Mannose cũng ựược tìm thấy trong thành phần của polysaccharide ựược cấu tạo chỉ từ các ựơn vị mannose, gọi là mannan. Mannan ở nấm men ựược cấu tạo từ D-mannose và hiện diện trong vách tế bào của nấm men, chỉ khoảng 16% trọng lượng khô của nấm men bánh mì là mannose (Falcone và ctv, 1956). Mannan với 1-4 ựơn vị liên kết cũng ựược tìm thấy ở quả dừa ngà (Hudson và csv, 1934).

Hình 2.11: Cấu tạo hóa học ựường Mannose và Mannose-6-phosphate. Quá trình chuyển hóa mannose ựược thể hiện ở hình 2.12. Mannose ựược tạo ra từ mannose-6-phosphate (M-6-P), và mannose-6-phosphate (M-6-P) lại ựược tạo ra từ fructose-6-phosphate (F-6-P) thông qua hoạt ựộng của enzyme phosphomannoisomerase (PMI). Enzyme phosphoglucoisomerase (PGI) ựược phát hiện ựầu tiên bởi Lohmann( 1933). Trong quá trình nghiên cứu dịch trắch từ nấm men người ta thấy rằng enzyme này vẫn có thể chuyển hóa ựược M-6-P từ F-6-P nên trong có một số ý kiến cho rằng trong dung dịch enzyme PGI có một loại enzyme riêng biệt với PGI (Slein và ctv, 1950), và nó ựược ựặt tên là PMI. Slein( 1950) ựã chứng minh ựược rằng PMI là một enzyme riêng biệt với PGI nhưng ông không thể tìm ra cách ựể tách riêng PMI trong quá trình hoạt ựộng của PGI.

Thành tựu ựầu tiên trong việc tách chiết PMI ra khỏi PGI của nấm men ựó là kết quả nghiên cứu của Noltmann và Bruns (1958). Trong mỗi phân tử PMI có chứa một nguyên tử kẽm(Gracy, 1968), và trọng lượng phân tử khoảng 45,000(Bruns, 1958). Trên thực tế người ta sử dụng mannose như là một ựộc chất cho con Ong mật bởi vì ong mật không có enzyme PMI chuyển mannose. PMI cũng ựược tìm thấy trong mô cơ của thỏ(Kizer và ctv, 1960). Nó cũng ựược tìm thấy trong các bộ phận của người như niêm mạc ruột, thận, tim, gan, não, phổi

(Alvarado và ctv, 1957), lá lách (Kizer và ctv, 1960), tế bào hồng cầu (Bruns và ctv, 1958), và trong các loại tế bào biểu mô.

Mannose ựược phosphoryl hóa bởi enzyme trong cơ thể thành M-6-P, và quá trình này cần sử dụng ATP. điều này ựã ựược nghiên cứu ở nấm men (Berger và ctv, 1946) và ở não (Sols, 1954). Emzyme Glucose-6-phosphatase cũng giúp tạo ra M-6-P và orthophosphate từ mannose và pyrophosphate (Beutler và ctv, 1969) .M-6-P ựóng vai trò như một cơ chất cho Glucose-6-phosphatase tạo ra orthophosphate và mannose. Sự phosphoryl hóa mannose bị ức chế cạnh trạnh bởi glucose và quá trình phosphoryl hóa glucose cũng bị ước chế ngược lại bởi mannose. Sự hoạt ựộng của PMI hiện diện trong tế bào hồng cầu và thay ựổi tùy theo ựộ tuổi của tế bào, ựược tăng cao ở các tế bào còn trẻ. Sự tắch lũy M-6-P ở tế bào hồng cầu thực chất chắnh là sự tắch lũy mannose, chỉ ra rằng PMI là mức giới hạn cho quá trình chuyển hóa mannose trong tế bào hồng cầu.M-6-P sau ựó ựược chuyển thành mannose-1-phosphat (M-1-P) có lẽ tương tự quá trình chuyển hóa G-6-P thành glucose-1-phosphate (G-1-P) bằng enzyme phosphoglucomutase (Khan và ctv. 1961). Enzyme có liên quan ựến quá trình này có thể là một loại enzyme phosphomannomutase riêng biệt bởi vì phosphoglucomutase hoạt khá chậm trên M-1-P (Posternak và ctv, 1953). Enzyme phosphomannomutase ựã ựược chứng minh ở nấm men, nơi mà quá trình phản ứng ựược thực hiện dể dàng bởi cả glucose-1,6-diphosphate (G-1,6- P2) hoặc mannose-1,6-diphosphate (M-1,6-P2) (Glaser và ctv, 1959).

Hình 2.12. Chu trình chuyển hóa ựường mannose.

Tóm lại mannose khi ựược hấp thu vào cơ thể sẽ ựược chuyển hóa thành hai dạng chắnh, một là tạo thành F-6-P như sự xúc tác của PMI, hai là chuyển hóa tạo thành M-1-P từ ựó tham gia vào thành phần cấu tạo, và các hoạt ựộng khác của tế bào.

V. Giống lúa Taipei 309

Oryza sativa L. gồm ba loài phụ là indica, japonica, và javanica. Trong ựó, indica phát triển tốt ở khắ hậu nhiệt ựới và vùng xắch ựạo, japonica lại phát triển tốt ở hầu hết những nơi khắ hậu lạnh như Nhật Bản, đài LoanẦcòn javanica lại ựược trồng nhiều ở châu Mỹ và châu Âu (Wallace và ctv, 2008). Lúa Taipei 309 thuộc loài phụ japonica có xuất xứ từ đài Bắc và ựược sử dụng nhiều dùng làm vật liệu chuyển gen trong chuyển gen lúa như tạo ra Gạo Vàng (Ye, X.D và ctv, 2000), tạo giống lúa mới có hàm lượng các vi chất như vitamin A, E, chất sắt, kẽm cao bằng sung bắn gen (Trần Thị Cúc Hòa và ctv, 2006)ẦỞ Việt Nam, triển vọng trong nghiên cứu giống lúa Taipei 309 là rất cao, vì mặc dù giống lúa Taipei 309 thắch hợp phát triển ở nhiệt ựộ thấp nhưng hiệu quả chuyển gen trên các giống lúa japonica thường cao hơn so với indica nên người ta thường dùng giống lúa này ựể thực hiện biến ựổi gen, chọn lọc dòng ựể lai với giống lúa indica nhằm mang lại hiệu quả cao hơn (Trần Thị Cúc Hòa và ctv, 2006). Một số ựặc tắnh của giống lúa TaiPei 309:

− Thời gian sinh trưởng: khoảng 130 ngày.

− Ngày trỗ: khoảng 100 ngày.

− Chiều cao cây: khoảng 130 cm.

− Số lượng chồi: 14/ bụi.

VI. Thử Nghiệm Chlorophenol-red (CPR)

đây là một phương pháp kiểm tra ựơn giản và nhanh chóng và hiệu quả ựể xác ựịnh thực vật chuyển gen trong phương pháp chọn lọc bằng Mannose. Thông thường người ta dùng các mẫu lá hoặc rễ của cây cần kiểm tra ựể ngâm trong dung dịch có chứa Mannose và Chlorophenol Red. Quá trình biến dưởng của cây ựã ựược chuyển gen sẽ gây ra hiện tượng acid hóa làm ựổi màu môi trường. Sự thay ựổi màu của dung dịch thử nghiệm Chlorophenol Red phụ thuộc vào pH của môi trường (Trieu and Harrison, 1996). Ở pH là 6.0 hoặc cao hơn, dung dịch sẽ có màu ựỏ, trái lại ở pH thấp hơn thì dung dịch sẽ có màu vàng.

PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

*****+☺☺☺☺+*****

I. Phương tiện

Thắ nghiệm ựược tiến hành tại phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường đại Học Cần Thơ.

1. Giống lúa

Chuyển gen bằng Agrobacterium thực hiện trên giống lúa Taipei 309 thuộc dòng Japonica. Giống lúa do phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường đại Học Cần Thơ cung cấp.

2. Dòng vi khuẩn

Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ựược sử dụng là C58/pMP90.

3. Plasmid

Plasmid ựược sử dụng là plasmid CAMBIA 1380-pmi (Hình 3.1).

4. Môi trường

Các môi trường ựược sử dụng trong nghiên cứu gồm:

− Môi trường tạo mô sẹo RO0.(Xem phụ lục 1)

− Môi trường lỏng ựể chuyển gen RO1. (Xem phụ lục 1)

− Môi trường ựồng nuôi cấy RO2. (Xem phụ lục 1)

− Môi trường tiền nuôi cấy Recorver. (Xem phụ lục 1)

− Môi trường chọn lọc lần thứ nhất RO3. (Xem phụ lục 1)

− Môi trường chọn lọc lần thứ hai RO4. (Xem phụ lục 1)

− Môi trường chọn lọc lần thứ ba RO5. (Xem phụ lục 1)

− Môi trường tiền tạo chồi RO6, tạo chồi RO7. (Xem phụ lục 2)

40 5. Thiết bị và dụng cụ a) Thiết bị − Tủ cấy. − Tủ ủ. − Máy ựo pH. − Máy khuấy từ. − Cân hóa chất.

− Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (1210C, 1 atm)Ầ..

b) Dụng cụ

− đĩa petri.

− Chai thủy tinh 100, 250, 500, 1000 mlẦẦ.

− Bình tam giác, giấy lọcẦẦ.

II. Phương pháp nghiên cứu

1. Qui trình chuyển gen

Hình 3.2. Quy trình chuyển gen trên lúa bằng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens.

Ớ Chú thắch:

− ng= ngày

− t= tuần

a) Phương pháp xử lý tạo mô sẹo

Vật liệu ựược dùng ựể tạo mô sẹo ựó là hạt lúa của giống Taipei 309. Chọn những hạt lúa còn nguyên vẹn, sau ựó tiến hành bóc vỏ hạt sao cho không làm tổn thương phần phôi của hạt lúa.

Sau khi bóc vỏ xong, chọn những hạt gạo có phần phôi nhũ trắng, không bị ựen và có phôi hoàn chỉnh cho vào một bình tam giác (ựã ựược khử trùng), tiếp tục tiến hành khử trùng hạt gạo theo các bước sau:

− Cho cồn 700 vào bình tam giác sao cho vừa ngập các hạt gạo, và lắc