1. Qui trình chuyển gen
Hình 3.2. Quy trình chuyển gen trên lúa bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens.
Ớ Chú thắch:
− ng= ngày
− t= tuần
42
a) Phương pháp xử lý tạo mô sẹo
Vật liệu ựược dùng ựể tạo mô sẹo ựó là hạt lúa của giống Taipei 309. Chọn những hạt lúa còn nguyên vẹn, sau ựó tiến hành bóc vỏ hạt sao cho không làm tổn thương phần phôi của hạt lúa.
Sau khi bóc vỏ xong, chọn những hạt gạo có phần phôi nhũ trắng, không bị ựen và có phôi hoàn chỉnh cho vào một bình tam giác (ựã ựược khử trùng), tiếp tục tiến hành khử trùng hạt gạo theo các bước sau:
− Cho cồn 700 vào bình tam giác sao cho vừa ngập các hạt gạo, và lắc ựều trong vòng 1 phút.
− đổ bỏ cồn nhẹ nhàng sao cho các hạt gạo không bị rớt ra ngoài, sau ựó tiếp tục cho vào dung dịch nước Javel (5-25% sodium hypochloride) vào ngập hạt + nhỏ 1-2 giọt Tween 20, ựặt lên máy khuấy từ và lắc ở tốc ựộ 50 vòng/ phút trong 25 phút.
− Sau khi ựã khử trùng với Javel, ựem bình tam giác ựó vào tủ cấy vô trùng và tiến hành rửa hạt từ 7-10 lần bằng nước cất ựã ựược khử trùng.
Hạt gạo sau ựó ựược cho vào một ựĩa petri có lót giấy thấm ựã ựược khử trùng ựể thấm khô hạt gạo khoảng 10-15 phút, rồi dùng kẹp cấy lần lượt chuyển các hạt gạo lên môi trường tạo mô sẹo RO0 và tiến hành nuôi cấy trong ựiều kiện chiếu sáng liên tục ở nhiệt ựộ 320C trong 5 ngày.
b) Các bước chuyển gen
Trước khi chuyển gen, dùng kim cấy chuyển vi khuẩn từ ựĩa nuôi cấy vi khuẩn vào bình có chứa môi trường RO1, nồng ựộ vi khuẩn ựược ựo OD ở bước sóng A600 là khoảng 0,05-0,1 , ựồng thời cho vào dung dịch nuôi vi khuẩn Acetosyringone với nồng ựộ 100ộM, sau ựó dung dịch sẽ ựược ựưa vào máy lắc ở 280C trong 1 giờ.
Mô sẹo sau 5 ngày tuổi sẽ ựược chọn lựa những mô phát triển tốt, và cho vào một chai thủy tinh vô trùng ựể chuẩn bị chuyển gen.
43
Mô 5 ngày tuổi sẽ ựược ngâm với dung dịch RO1 có chứa vi khuẩn trong 2 phút, sau ựó ựổ bỏ dung dịch có chứa vi khuẩn. Mô ựược làm khô trên giấy thấm vô trùng khoảng 1 phút ựể thấm bớt lượng vi khuẩn dư thừa và tiến hành cấy lên môi trường RO2, môi trường RO2 ựã ựược lót một lớp giấy thấm Whatmen (giấy thấm ựã ựược thấm ướt bằng dung dịch môi trường RO1).
Các ựĩa môi trường RO2 có chứa mô ựã ựược chuyển gen ựược ựem ựi ựồng nuôi cấy trong tủ ủ ở 250C ở ựiều kiện tối trong 3 ngày.
c) Chọn lọc mô chuyển gen
Sau 3 ngày ựồng nuôi cấy, mô ựược chuyển lần lượt sang môi trường chọn RO3, RO4, RO5(xem phụ lục 1) có nồng ựộ mannose tăng dần và nồng ựộ sucrose giảm dần ựể chọn lọc các mô ựược chuyển gen, mỗi lần chuyển mô sang môi trường mới cách nhau 2 tuần và ựồng thời ta sẽ chọn những mô sẹo còn sống và phát triển tốt trên môi trường chọn lọc, loại bỏ những mô xấu. Trong mỗi môi trường chọn lọc có bổ sung thêm 400mg/L carbenicillin (300g/ml) ựể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
d) Tạo chồi
Những mô nào cuối cùng còn có thể phát triển tốt trên môi trường RO5 (tạo ựược mô sẹo mới) có nghĩa là ựã ựược chuyển gen thành công, những mô này tiếp tục sẽ ựược chuyển lần lượt sang môi trường tạo tái sinh chồi và rễ, cho ựến khi tạo thành cây con hoàn chỉnh. Cụ thể như sau:
Mô sống sót ựược sau hai tuần trên môi trường RO5 sẽ ựược chuyển tiếp sang môi trường RO6, và ựể mô phát triển tiếp trong vòng 1 tuần. Sau ựó, mô ựược chuyển sang môi trường RO7 trong 2 tuần. Khi chồi phát triển khoảng 2- 3cm thì chuyển mô sang môi trường RO8 ựể tạo rễ.
44
2. Bố trắ thắ nghiệm
a) Chuyển gen pmi bằng Agrobacterium tumefaciens
Phương pháp chuyển gen ựược dựa theo qui trình của Philippe và Toshiaki (2006). Mô sẹo năm ngày tuổi của lúa Taipei 309 ựược chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58/pMP90 có chứa vectơ pCAMBIA 1380-pmi (Hình 3.1). Sau 3 ngày ựồng nuôi cấy, mô ựược chuyển sang môi trường tiền chọn lọc (Recover) chứa 3% sucrose và 400 mg/L Carbenicilline trong một tuần. Sau ựó chuyển mô sang môi trường chọn lọc 1(RO3) trong hai tuần, môi trường này có chứa 3% sucrose và 3% mannose. Hai tuần tiếp theo mô ựược nuôi trên môi trường chọn lọc 2(RO4) chứa 1,5% sucrose và 3% mannose. Cuối cùng các mô ựược chuyển sang môi trường chọn lọc 3 (RO5) trong hai tuần, môi trường chỉ chứa 4% mannose. Tất cả các môi trường chọn lọc ựều chứa 400 mg/L Carbenicilline ựể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau sáu tuần chọn lọc ở ựiều kiện chiếu sáng liên tục, nhiệt ựộ 330C và ựộ ẩm 50%, các mô có thể sống và phát triển ựược trên môi trường chọn lọc sẽ ựược quan sát và ghi nhận lại.
b) Ảnh hưởng của Mannose lên quá trình tạo chồi
Các mô sống ựược trên môi trường chọn lọc 3 (chỉ chứa ựường Mannose) sẽ ựược tái sinh trong các môi trường tạo chồi. Mô sau một tuần trên môi trường tiền tạo chồi RO6 sẽ ựược chuyển tiếp tục hai tuần trên RO7 ựể tạo chồi. Khảo sát ảnh hưởng của ựường mannose lên quá trình tạo chồi ựược tiến hành như sau:
Ảnh hưởng của Mannose trong môi trường tiền tạo chồi (RO6)
− Nghiệm thức 1: mô ựược nuôi cấy trên môi trường tiền tạo chồi RO6.
− Nghiệm thức 2: mô ựược nuôi cấy trên các môi trường tiền tạo chồi RO6 ỜMannose (2% Mannose.)
Ảnh hưởng của Mannose trong môi trường tạo chồi (RO7)
− Nghiệm thức 1: mô ựược nuôi cấy trên môi trường tạo chồi RO7.
− Nghiệm thức 2: mô ựược nuôi cấy trên môi trường tạo chồi RO7- Mannose (1.5% Mannose.)
45
Trước khi chuyển mô ựã qua thanh lọc sang môi trường tiền tái sinh, các mô này sẽ ựược tách nhỏ ra và nuôi tiếp trên môi trường chọn lọc RO5 nhằm mục ựắch tăng sinh khối mô chọn lọc, ựủ dùng cho các thắ nghiệm thử ựộ nhạy cảm của quá trình tạo chồi trong ựiều kiện có chứa ựường Mannose.
Các mô ựã thanh lọc sau khi ựược nhân lên cho ựủ sinh khối sẽ ựược chuyển sang môi trường tiền tạo chồi RO6 và RO6-mannose. Sau một tuần nuôi cấy, mô ựược quan sát dưới kắnh soi nổi ựể theo dõi sự biệt hóa. Sau ựó, các mô này lại ựược chuyển tiếp sang môi trường tạo chồi RO7 và RO7-mannose trong 2 tuần.
c) Thử nghiệm Chlorophenol ựỏ (Chlorophenol red-CPR)
Thử nghiệm Chlorophenol ựỏ (CPR) (Kramer và ctv, 1993) ựược thực hiện nhằm xác ựịnh các mô hay cây chuyển gen. Các mẫu cấy của cây chuyển gen trong giai ựoạn ựang ra rễ (5mm) trong ựiều kiện vô trùng ựược sử dụng ựể thử nghiệm Chlorophenol ựỏ. Các mẫu ựược ngâm trong những giếng (well) riêng biệt trong ựĩa trắc nghiệm (multi-well plate) chứa môi trường lõng MS1 (Murashige and Skoog, 1992)(phụ lục 3) ở pH 5,8 trong khoảng 30-60 phút. Sau ựó loại bỏ môi trường MS1 ra khỏi giếng và mẫu ựược ủ với 500 ộl môi trường MS2 (phụ lục 3) có 2mg/ml chlorophenol ựỏ ở pH 6,0 (ở pH này chlorophenol ựỏ có màu ựỏ ựậm). Mẫu ựược ủ trong ựiều kiện chiếu sáng ở 320C trong 3-4 ngày. Sự biến ựổi màu (từ ựỏ sang vàng) của các mẫu sẽ ựược ựánh giá.
46
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN *****+☺☺☺☺+*****
I. Chuyển gen pmi bằng Agrobacterium tumefaciens
Mô lúa sau một tuần trên môi trường tiền chọn lọc (Recover), sẽ ựược chọn lọc tuần tự trên các môi trường chọn lọc (RO3, RO4, RO5) có nồng ựộ ựường Mannose tăng dần(3% ở RO3 và RO4, 4% ở RO5) và kèm theo ựó là sự giảm dần nồng ựộ của ựường Sucrose (3%; 1,5%; 0%). Sự phát triển của mô ựã chuyển gen thành công trên môi trường chọn lọc thể hiện rõ nhất trên môi trường RO5, vì môi trường chọn lọc này chỉ chứa 4% Mannose và không có sự hiện diện của Sucrose nên chỉ những mô nào có gen pmi hay nói cách khác là có khả năng sử dụng mannose là nguồn carbon mới có thể phát triển tốt ựược (hình 4.1), còn những mô không thể sử dụng ựược Mannose sẽ tắch tụ nhiều mannose-6- phosphat từ ựó dẫn ựến việc ức chế sự phát triển của mô (Ferguson và csv, 1958; Malca và ctv, 1967).
47
Hiệu quả chuyển gen ựược tắnh bằng tỉ lệ mô có thể phát triển ựược trên môi trường chọn lọc 3 (RO5) trên tổng số mô sẹo ựược chủng nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ở bảng 1 cho ta thấy số lượng mô ban ựầu dùng ựể chuyển gen là 400 mô, sau 4 tuần trên môi trường chọn lọc 1 và 2 thì sự biểu hiện của mô chuyển gen không có dấu hiệu rõ rệt, nhưng sau 2 tuần tiếp theo trên môi trường chọn lọc 3 thì ta có thể dể dàng thấy ựược sự phát triển sự phát triển của các mô chuyển gen. Trong 400 mô ban ựầu sau 6 tuần chọn lọc ta thu ựược 3 mô chuyển gen sau lần thanh lọc thứ ba. Hiệu suất chuyển gen thu ựược là 0,75%.
Bảng 1: Hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Taipei 309 khi sử dụng protocol mới
Tên giống Số mẫu thắ
nghiệm Số mô sống trên môi trường chọn lọc 3 Phần trăm chuyển gen (%) Taipei 309 400 3 0,75
Lucca và ctv (2000) là người ựầu tiên báo cáo về việc sử dụng phương pháp chọn lọc bằng mannose trong chuyển gen ở Taipei 309 bằng Agrobacterium dòng LBA4404. Mô từ phôi lúa chưa trưởng thành sau 6 tuần chọn lọc trong tối với nồng ựộ mannose tăng dần và sử lý tạo chồi không có sự hiện diện của mannose, ựạt ựược hiệu suất chuyển gen lên ựến 41%. Zhengquan và ctv (2003) cũng dùng mô từ phôi lúa japonica I-S chưa trưởng thành ựể chuyển gen, hiệu suất thu ựược tối ựa là 6%.
Qui trình chuyển gen chúng tôi ựã thực hiện dựa trên qui trình của Philippe và Toshiaki (2006). Theo báo cáo của tác giả, hiệu quả chuyển nạp gen ở lúa Nipponbare là 29%, dòng vi khuẩn ựược dùng trong thắ nghiệm là
48
Agrobacterium LBA4404. Thắ nghiệm của chúng tôi sử dụng giống lúa Taipei 309 ựược trồng ở ựiều kiện khắ hậu vùng đồng bằng sông Cửu Long, dòng vi khuẩn ựược sử dụng trong thắ nghiệm của chúng tôi là Agrobacterium C58/pMP90. Có thể chất lượng của hạt lúa Taipei 309 khi trồng ở ựiều kiện Việt Nam sẽ không ựạt tiêu chuẩn, ựiều này sẽ ảnh hưởng ựến khả năng tái sinh trong nuôi cấy in-tro, ngoài ra dòng vi khuẩn mà chúng tôi sử dụng trong chuyển gen ở lúa có thể không có hiệu quả biến nạp gen bằng dòng LBA 4404.
Hình 4.2: Mô không chuyển gen bị ức chế trên môi trường RO5.
49
II. Ảnh hưởng của Mannose lên quá trình tạo chồi
1. Ảnh hưởng của Mannose trong môi trường tiền tạo chồi (RO6)
Kết quả thắ nghiệm bảng 2 cho thấy các mô sau khi thanh lọc trên môi trường RO5 khi ựược nuôi cấy trên môi trường RO6 trong 1 tuần có sự phát triển và biệt hóa rất tốt ựạt tỷ lệ 100% . Trong khi các mô ựược nuôi ở môi trường RO6 + 2% Maltose có dấu hiệu nâu hóa và không phát triển, sự phát triển chỉ ựạt 16,7%, thấp hơn gần 6 lần so với trên môi trường không có sự hiện diện của mannose. Sự phát triển và không phát triển của mô chuyển gen trên hai môi trường ựược thể hiện ở hình 4.4.
Bảng 2: Khả năng tạo chồi trên hai môi trường RO6 và RO6-mannose sau 1 tuần
Môi Trường Tổng số mô Số mô phát
triển tốt Số mô không phát triển Phần trăm phát triển(%) Phần trăm mô không phát triển(%) RO6 30 30 0 100 0 RO6- Mannose 30 5 25 16,7 83,3
50
Hình 4.4: Sự phát triển của mô chuyển gen trên môi trường tiền tạo chồi. A: mô chuyển gen khi mới cấy lên môi trường RO6.
B: mô chuyển gen sau một tuần trên môi trường RO6.
C: mô chuyển gen khi mới cấy lên môi trường RO6-Mannose. D: mô chuyển gen sau một tuần trên môi trường RO6-Mannose.
51
2. Ảnh hưởng của Mannose trong môi trường tạo chồi (RO7)
Ảnh hưởng của Mannose lên sự tạo chồi thể hiện rõ nhất trên mô ựược nuôi cấy trên môi trường RO7. Trên môi trường RO7 sau 1 tuần ựã có dấu hiệu của việc phát triển chồi rõ rệt (hình 4.5 và hình 4.6). Kết quả ở bảng 2 cho thấy khả năng tạo chồi của mô sẹo trên môi trường RO7 không chứa Mannose và RO7-Mannose có sự khác biệt ựáng kể. Ở môi trường RO7 tỉ lệ tạo chồi ựạt 60%, cao hơn gần 4 lần so với môi trương RO7-Mannose (15,4%). Còn số mô bị chết hoàn toàn ở trên môi trường RO7-Mannose là 23,1%, trong khi trên môi trường RO7 không có mô nào chết.
Bảng 3: Khả năng tạo chồi trên hai môi trường RO7 và RO7-mannose sau 1 tuần. Môi Trường Tổng số mô Số mô tạo chồi Số mô chết hoàn toàn Phần trăm mô tạo chồi (%) Phần trăm mô chết (%) RO7 15 9 0 60 0 RO7- Mannose 13 2 3 15,4 23,1
52
Hình 4.5: Mô sẹo hình thành chồi trên môi trường RO7.
53
Quá trình hình thành chồi của mô lúa không qua sự thanh lọc bằng ựường mannose phát triển rất tốt. Bổ sung thêm 1.5-2% Mannose trong môi trường tạo chồi dẫn ựến ức chế sự phát triển và biệt hóa của mô và mô có thể chết một vài tuần sau ựó. Kết quả này cho thấy quá trình tạo chồi nhạy cảm với ựường Mannose hơn quá trình hình thành mô sẹo (mô sẹo có thể phát triển trên môi trường có nồng ựộ mannose lên ựến 4%). Quá trình ức chế sự tạo chồi của mô chuyển gen trên môi trường có chứa Mannose có thể là do sự mất nguồn năng lượng bởi tác ựộng gián tiếp của hexokinase. Pego và ctv (1999) ựã chứng minh rằng hexokinase có liên quan ựến sự ức chế quá trình nẩy chồi của hạt cây Arabidopsis. Quá trình phosphoryl hóa ựường Mannose bởi hexokinase như là một tắnh hiệu cho sự ức chế gen và sự hao hụt năng lượng trong suốt quá trình nảy chồi của hạt.
Một số nghiên cứu về quá trình tạo chồi của cây chuyển gen với hệ thống chọn lọc bằng ựường Mannose cũng cho kết quả tương tự. Theo kết quả nghiên cứu của Zhengquan và ctv (2003) trên giống lúa Japonica Ishikari-shiroge(I-S) cho thấy khả năng tạo chồi của giống lúa này trên môi trường có chứa Mannose là 0%, trong khi khả năng tạo chồi ở môi trường không có Mannose lại ựạt hiệu quả ựến 95%. Byung và ctv (2006) khi nghiên cứu ảnh hưởng của Mannose lên quá trình tạo chồi của cải bắp chuyển gen, cũng cho thấy rằng ở môi trường có 20 g l-1 sucrose và 0-3 g l-1 mannose thì quá trình tạo chồi phát triển bình thường. Tuy nhiên, ở nồng ựộ 4 g l-1 hoặc hơn thì quá trình tạo chồi hoàn toàn không xảy ra. Ngoài ra việc không sử dụng mannose như nhân tố chọn lọc trong quá trình tạo chồi còn có thể bắt gặp ở chuyển gen trên Arabidopsis thaliana (Rebecca và Brian, 2001), cây táo (Juliana và ctv, 2006), cây ựu ựủ (Yun và ctv, 2005).
54
IV. Phân tắch Chlorophenol-Red (CPR)
Mặc dù các mô sẹo ựã qua thanh lọc khi chuyển sang môi trường tạo chồi ựã ựược khuyến cáo không nên sử dụng mannose trong môi trường tạo chồi ựể chọn lọc. Tuy nhiên các cây tái sinh vẫn ựược tiếp tục nhận diện là cây ựã chuyển gen hay không dựa vào phương pháp phân tắch Chlorophenol-Red (CPR), phương pháp này ựược ựánh giá là có hiệu quả cao trong việc nhận biết cây chuyển gen (Lucca và ctv, 2001; Wright và ctv, 2001). Sau khi ựược tái sinh trên môi trường RO8 và trước khi cây con ựược ựem ra trồng trong nhà kắnh, rễ của cây tái sinh ựược phân tắch bằng phương pháp khảo sát (CPR). Trong dung dịch chứa chất chỉ thị CPR, nếu pH của dung dịch là 6.0 hoặc lớn hơn thì dung dịch có màu ựỏ ựậm. Nhưng khi dung dịch thử nghiệm bị acid hóa do hoạt ựộng chuyển hóa mannose của các tế bào sống, sẽ làm cho môi trường có màu vàng. Kết quả khảo sát (Hình 4.9) cho thấy rễ của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo ựã phát triển tốt trên môi trường chọn lọc RO5 ựều ựổi sang màu vàng, giống như sự biến ựổi màu ở mẫu ựối chứng dương (rễ cây chuyển gen PMI mẫu). Ngược lại,