I. Phương pháp chọn lọc bằng Mannose
2. Ảnh hưởng của Mannose trong môi trường tạo chồi
Ảnh hưởng của Mannose lên sự tạo chồi thể hiện rõ nhất trên mô ựược nuôi cấy trên môi trường RO7. Trên môi trường RO7 sau 1 tuần ựã có dấu hiệu của việc phát triển chồi rõ rệt (hình 4.5 và hình 4.6). Kết quả ở bảng 2 cho thấy khả năng tạo chồi của mô sẹo trên môi trường RO7 không chứa Mannose và RO7-Mannose có sự khác biệt ựáng kể. Ở môi trường RO7 tỉ lệ tạo chồi ựạt 60%, cao hơn gần 4 lần so với môi trương RO7-Mannose (15,4%). Còn số mô bị chết hoàn toàn ở trên môi trường RO7-Mannose là 23,1%, trong khi trên môi trường RO7 không có mô nào chết.
Bảng 3: Khả năng tạo chồi trên hai môi trường RO7 và RO7-mannose sau 1 tuần. Môi Trường Tổng số mô Số mô tạo chồi Số mô chết hoàn toàn Phần trăm mô tạo chồi (%) Phần trăm mô chết (%) RO7 15 9 0 60 0 RO7- Mannose 13 2 3 15,4 23,1
52
Hình 4.5: Mô sẹo hình thành chồi trên môi trường RO7.
53
Quá trình hình thành chồi của mô lúa không qua sự thanh lọc bằng ựường mannose phát triển rất tốt. Bổ sung thêm 1.5-2% Mannose trong môi trường tạo chồi dẫn ựến ức chế sự phát triển và biệt hóa của mô và mô có thể chết một vài tuần sau ựó. Kết quả này cho thấy quá trình tạo chồi nhạy cảm với ựường Mannose hơn quá trình hình thành mô sẹo (mô sẹo có thể phát triển trên môi trường có nồng ựộ mannose lên ựến 4%). Quá trình ức chế sự tạo chồi của mô chuyển gen trên môi trường có chứa Mannose có thể là do sự mất nguồn năng lượng bởi tác ựộng gián tiếp của hexokinase. Pego và ctv (1999) ựã chứng minh rằng hexokinase có liên quan ựến sự ức chế quá trình nẩy chồi của hạt cây Arabidopsis. Quá trình phosphoryl hóa ựường Mannose bởi hexokinase như là một tắnh hiệu cho sự ức chế gen và sự hao hụt năng lượng trong suốt quá trình nảy chồi của hạt.
Một số nghiên cứu về quá trình tạo chồi của cây chuyển gen với hệ thống chọn lọc bằng ựường Mannose cũng cho kết quả tương tự. Theo kết quả nghiên cứu của Zhengquan và ctv (2003) trên giống lúa Japonica Ishikari-shiroge(I-S) cho thấy khả năng tạo chồi của giống lúa này trên môi trường có chứa Mannose là 0%, trong khi khả năng tạo chồi ở môi trường không có Mannose lại ựạt hiệu quả ựến 95%. Byung và ctv (2006) khi nghiên cứu ảnh hưởng của Mannose lên quá trình tạo chồi của cải bắp chuyển gen, cũng cho thấy rằng ở môi trường có 20 g l-1 sucrose và 0-3 g l-1 mannose thì quá trình tạo chồi phát triển bình thường. Tuy nhiên, ở nồng ựộ 4 g l-1 hoặc hơn thì quá trình tạo chồi hoàn toàn không xảy ra. Ngoài ra việc không sử dụng mannose như nhân tố chọn lọc trong quá trình tạo chồi còn có thể bắt gặp ở chuyển gen trên Arabidopsis thaliana (Rebecca và Brian, 2001), cây táo (Juliana và ctv, 2006), cây ựu ựủ (Yun và ctv, 2005).
54