b. Định lượng hoạt tính bằng phương pháp Nelso n Somogyi
4.4.Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký ion âm với gel Uno Sphere Q
Sphere Q
Hình 20. Sắc ký đồ phân đoạn 50 – 80% AS Bảng 7: Sắc ký trên gel Uno Sphere Q
Phân đoạn Thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Nồng độ NaCl (M) UB 23 0,2 ± 0,052 0 0 0 FI 37 2,8 ± 0,067 236 ± 47,8 84,2 0,750
Dịch enzyme sau khi tủa với ammonium sulfate từ 40 – 80% AS được cho qua cột sắc ký trao đổi ion âm Uno Sphere Q. Dung dịch Tris-HCl 50mM pH 8,5 được cho qua cột sắc ký để loại các protein không bám trên cột. Sau đó, gradient nồng độ muối NaCl từ 0 – 1 M được cho qua cột để rửa giải protein mục tiêu bám trên cột. Theo Kim et al. (1997) và Karnchanatat et al. (2008) endoglucanase từ vi khuẩn có điểm đẳng điện (pI) từ 4,9 – 6,2 nên khi hòa tan trong dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM pH 8,5 enzyme tích điện âm nên sử dụng cột trao đổi ion âm Uno Sphere Q là thích hợp để các protein mục tiêu mang điện tích âm được giữ lại trên cột sắc ký. Kết quả sắc ký đồ cho thấy dịch enzyme sau khi sắc ký tách thành 2 phân đoạn, gồm 1 phân đoạn không bám (UB) và một phân đoạn bám (FI) (Bảng 7). Phân đoạn không bám thu được rất ít protein (0,2 mg) và hầu như không thể hiện hoạt tính enzyme. Trong khi đó phân đoạn bám được rửa giải ở nồng độ NaCl tương đương 0,75 M và thu được lượng protein rất
nhiều (2,8 mg) đồng thời thể hiện hoạt tính enzyme khá cao (236 U). Điều đó cho thấy quá trình tinh sạch với ammonium sulfate đạt được hiệu quả cao khi đã loại bỏ hầu hết các protein không mong muốn.
Kết quả định tính endoglucanase tinh sạch bằng phương pháp thủy phân cơ chất CMC với chất nhuộm congo red.
Hình 21. ĐKTP endoglucanase
(a): Mẫu thô; (b): Phân đoạn tủa 50 - 80% AS
Hình 22. ĐKTP endoglucanase
(a): Phân đoạn không bám (UB); (b): Phân đoạn bám (F)
Kết quả định tính cho thấy ở mẫu thô hầu như không thể hiện hoạt tính endoglucanase (Hình 21a). Sau khi tủa với tỉ lệ 50 - 80% ammonium sulfate, endoglucanase đã sơ bộ được tinh sạch, qua đó thể hiện hoạt tính trên cơ chất CMC.
Tuy nhiên hoạt tính lúc này vẫn chưa cao (Hình 21b). Sau quá trình sắc ký phân đoạn FI thể hiện rõ hoạt tính trên cơ chất với đường kính vòng halo to hơn và rõ ràng hơn (Hình 22b). Trong khi đó, phân đoạn UB không có hoạt tính enzyme (Hình 22a).
Hình 23. Điện di SDS-PAGE
Giếng 1: enzyme thô; Giếng 2: phân đoạn FI; Giếng 3: Unbound; Giếng 4: phân đoạn tủa AS 80%, Giếng 5: phân đoạn tủa AS 40%
Kết quả điện di cho thấy sau khi sắc ký phân đoạn FI thể hiện rõ 2 băng protein với trọng lượng phân tử lần lượt là 64,4 kDa và 60,4 kDa. Trong khi đó ở phân đoạn UB hầu như không xuất hiện băng protein chứng tỏ phần lớn enzyme đã được rửa giải và thu lại trong phân đoạn FI.
Bảng 8: Tóm tắt quy trình tinh sạch Bước tinh sạch Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch (lần) Dịch thô 51,3 610 11,9 100 1 AS 50 – 80% 3,9 245 62,7 40,1 5,27 Unosphere Q 2,79 236 84,5 38,6 7,10
Qua 2 bước tinh sạch, quá trình tinh sạch đạt được hiệu suất là 38,6% và độ tinh sạch là 7 lần (Bảng 8).
So sánh giữa mẫu thô và phân đoạn FI có thể thấy các băng protein có sự chênh lệch nhau về khối lượng, điều đó chứng tỏ ở mẫu thô có các protein khác và sau quá trình tinh sạch, ta đã loại bớt được những protein tạp và thu lại enzyme mong muốn. Ở phân đoạn tủa với 80% AS (giếng 4) và phân đoạn FI (giếng 2) sau sắc ký có thể thấy
1 2 3 4 5 Marker 18,4 kDa 116 kDa 45 kDa 66,2 kDa 35 kDa 25 kDa 14,4 kDa
cả 2 giếng đều có sự tương đồng về các băng protein nhưng ở giếng 4 thì 2 băng nhạt hơn và ở giếng 2 các băng protein xuất hiện rõ hơn, màu đậm và dày hơn. Không có nhiều tài liệu nghiên cứu về tinh sạch endoglucanase từ dòng vi khuẩn này nhưng có những nghiên cứu về tinh sạch enzyme này từ dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, là dòng vi khuẩn có môi trường sống tương tự và được phân lập từ cùng môi trường với vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans. Các nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của endoglucanase từ vi khuẩn là từ 35 - 65 kDa (Park et al., 1991; Han et al., 1995 và Kim et al., 1995) nên có thể cả 2 băng 64,4 kDa và 60,4 kDa đều là endoglucanase. Trọng lượng phân tử của enzyme này cao hơn so với endoglucanase từ Bacillus CTP- 09 (46 kDa) (Saleem et al., 2008), Bacillus sp. KSM 330 (42 kDa) (Ozaki và Ito, 1991) và Bacillus sp. (58 kDa) (Vijayaraghavan và Vincent, 2012). Bên cạnh đó, trọng lượng phân tử của enzyme này tương đương với endoglucanase từ dòng Bacillus pumilus (67 kDa) (Christakopoulos et al., 1999) và thấp hơn endoglucanase được tinh sạch từ Bacillus subtilis S2O (79,6 kDa và 74 kDa) (Hà Công Thắng, 2013). Tuy nhiên, hình ảnh điện di cho thấy sau quá trình sắc ký vẫn còn protein tạp, xuất hiện 1 băng protein 25 kDa và các băng protein vẫn còn nằm sát nhau nên chưa thể xác định được là 2 băng này có phải là đồng phân của nhau hay không. Tuy nhiên băng protein với trọng lượng 60,4 kDa có độ dày và bắt màu đậm hơn so với băng 64,4 kDa nên nhiều khả năng đây chính là trọng lượng phân tử của enzyme mong muốn. Do đó, cần phải thực hiện thêm những bước tinh sạch tiếp theo như sắc ký lọc gel và sắc ký tương tác kị nước nhằm loại bỏ các protein tạp và tách rời các băng protein. Qua đó, xác định trọng lượng phân tử của enzme này chính xác hơn.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate (AS), tủa với các dung môi hữu cơ ethanol và acetone được dùng đê tủa endoglucanase. Đối với tủa phân đoạn AS, phân đoạn 50 – 80% AS cho kết quả tủa tốt nhất. Tỉ lệ tủa tốt nhất với ethanol và acetone lần lượt là 1:3 và 1:4. Trong 3 phương pháp tủa, tủa phân đoạn với AS hiệu quả hơn so với 2 phương pháp còn lại với hàm lượng protein tổng và hoạt tính tổng thu được là 1,13 mg và 98,6 U.
Quá trình tinh sạch endoglucanase từ vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans
BM13 được thực hiện qua hai bước, tủa phân đoạn với ammonium sulfate từ 50 – 80% và sắc ký trao đổi ion âm trên gel Uno Sphere Q, đạt hiệu suất và độ tinh sạch lần lượt là 38,6% và 7 lần. Endoglucanase tinh sạch thu được có hoạt tính đặc hiệu 84,5 U/mg và sau khi điện di thể hiện 2 band protein với trọng lượng phân tử lần lượt là 64,4 kDa và 60,4 kDa.
5.2. Kiến nghị
Tiếp tục tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50 và sắc ký tương tác kị nước trên gel Phenyl – Sepharose để nghiên cứu thông số động học của endoglucanase.
Tìm phương pháp thu hồi lượng enzyme bám vào cơ chất nhằm thu được lượng enzyme cao hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Thanh Thủy. 2009. Đặc điểm của vi khuẩn phân lập từ xử lý sinh học tẩy độc nước thải bị ô nhiễm 2,4,6- trinitrotoluene. Tạp chí Công Nghệ Sinh Học. 7(3):389-396.
Hà Công Thắng. 2013. Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ
Bacillus subtilis S2O. Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến, Trường Đại học Cần Thơ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyễn Đức Lượng, 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM.
Nguyễn Hữu Chấn và Nguyễn Thị Hà. 1991. Hóa sinh. Nhà xuất bản Y học, trang 41- 47.
Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần Nguyễn Nhật Khoa và Thái Trần Phương Minh. 2013. Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm trên cây chuối. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ. 27:24-31.
Nguyễn Thị Xuân Thảo. 2013. Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của exoglucanase từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis S2O. Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Cần Thơ.
Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Mai và Nguyễn Thị Phương Chi. 2003. Khả năng chịu muối của một số chủng vi khuẩn phân giải phosphate khó tan. Tạp chí sinh học. 25(2):19-24.
Võ Văn Song Toàn, Bùi Thị Ngọc Hân, Trần Nhân Dũng. 2014. Đề tài khoa học và công nghệ cấp trường “Phân lập, tuyên chọn một số dòng nấm men có khả năng lên men cồn với cơ chất bã mía ở Cần Thơ, Hậu Giang, Bến Tre”.
Tiếng Anh
Bajaj, B.K., H. Pangotra, M.A. Wani, P. Sharma and A. Sharma. 2009. Partial purification and characterization of a highly thermostable and pH stable endoglucanase from a newly isolated Bacillus strain M-9. Indian. J. Chem. Techn., 16:382-387.
Bakare MK, Adewale IO, Ajayi A, Shonukan OO (2005). Purification and characterization of cellulase from the wild-type and two improved mutants of
Pseudomonas fluorescens. Afri. J. Biotechnol. 4:898-904.
Beguin, P. and J.P. Aubert. 1994. The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiol. Rev. 13:25–58.
Bhat, M.K. 2000. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnol. Adv.
18(5):355-383.
Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72:248-254.
Boraston, A.B., D.N. Bolam, H.J. Gilbert and G.J. Davies. 2004. Carbohydrate- binding modules: Fine-tuning polysaccharide recognition. Biochem. J. 382(3). Chawla, P.R., I.B. Bajaj, S.A. Survase and R.S. Singhal. 2009. Microbial Cellulose:
Fermentative Production and Applications. Food. Technol. Biotechnol.
47(2):107-124.
Copeland, R.A. 2000. Experimental Measure of Enzyme Activity. In Enzyme: A practical introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis, New York: Wiley-VCH, pp.229-245.
Coral, G., B. Arikan, M.N. Unaldi and H. Gunvenmes. 2002. “Some Properties of Crude Carboxymethyl Cellulase of Aspergillus niger Z10 Wild Type Strain,”
Turkish Jour- nal of Biology. 26(4):209-221.
Davis, B.J. 1964. Discontinuous electrophoresis. Ann. N.Y. Acad. Sci, pp. 404-427. Demain, A.L., M. Newcomb and J.H.D. Wu. 2005. Cellulases, clostridia, and ethanol.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69:124–154.
Duggan, J.M., S.J. Goldstein, C.E. Chenoweth, C.A. Kauffman and S.F. Bradley. 1996.
Achromobacter xylosoxidans Bacteremia: Report of Four Cases and Review of the Literature. Clin. Infect. Dis. 23:569-76.
Edgar, U., A. Ruiz, R. Montesino, G. Johansson and G. Pettersson. 1991. The 1,4-β-D- glucan cellobiohydrolases from Phanerochaete chrysosporium. I. A system of synergistically acting enzymes homologous to Trichoderma reesei. J. Biotechnol.
Esteve, N.A., A. Caballero and J.L. Ramos. 2001. Biological degradation of 2,4,6- trinitrotoluene. Microbiol. Mol. Biol.Rev. 65:335-352.
Guillen, D., S. Sanchez and R. Rodriguez-Sanoja. 2010. Carbohydrate-binding domains: Multiplicity of biological roles. Appl. Microbiol. Biot.
Hames, B.D. 1998. Gel electrophoresis of proteins: A practical approach, 3rd edition, New York: Oxford University Press, pp. 13-34.
Ho, Y.N., D.C. Hsiao, C.H. Shih, M.F. Chien, H.M. Chiang and C.C. Huang. 2012. Selection and application of endophytic bacterium Achromobacter xylosoxidans strain F3B for improving phytoremediation of phenolic pollutants. J. Hazard. Mater., 219-220: 43-9.
Immanuel, G., R. Dhanusha, P. Prema and A. Palavesam. 2006. Effect of different growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment. Int. J. Environ. Sci Technol., (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3(1):25-34.
Jakoby, W.B. 1971. Crystallization as a purification technique, Enzyme Purification and Related Techniques, in Methods in Enzymology, Academic Press, vol. 22 Janson, J.C. and L. Rydén. 1998. Protein purification: Principle, High-Resolution
method, and Application, 2nd edition, Canada: A John Wiley & Sons, pp. 03-41. Janson, J.C. and L. Rydén. 1998. Protein purification: Principle, High-Resolution
method, and Application, 2nd edition, Canada: A John Wiley & Sons, pp. 79-143. Janson, J.C. and L. Rydén. 1998. Protein purification: Principle, High-Resolution method, and Application, 2nd edition, Canada: A John Wiley & Sons, pp. 145-206. Jha, P. and A. Kumar. 2009. Characterization of novel plant growth promoting
endophytic bacterium Achromobacter xylosoxidans from wheat plant. Microb. Ecol, 58: 179-188.
Joe, M.M., M.R. Islam, B. Karthikeyan, K. Bradeepa, P.K. Sivakumarr and T. Sa. 2012. Resistance responses of rice to rice blast fungus after seed treatment with the endophytic Achromobacter xylosoxidans AUM54 strains. Crop Protection, 42: 141-148
Johnson, E.A., M. Sakajoh, G. Halliwell, A. Madia and A.L. Demain. 1982. Appl. Environ. Microbiol. 1125(43).
Julian, G.St., R.J. Bothast and H.L. Krull. 1990. Glycerol accumulation while recycling thin sillage in corn fermentation to ethanol. J. Ind. Microb. 5:391–394. Kanamoto, J., R. Sakamoto, M. Arai and S. Murao. 1979. J. Ferment. Technol.
163(57).
Lutzen, N.V. and M. H. Nielson. 1983. Cellulose and their application in the forming converson of lignocellulose to fermentable surgurs. Phil. Trans. R. Soc., London, 300: 283-291.
Mandell, W.F., G.J. Garvey and H.C. Neu. 1987. Achromobacter xylosoxydans
bacteremia. Natl. I. Health. 9(5):1001-5.
Maharana, A.K and P. Ray. 2013. Isolation and Screening of Cold Active Extracellular Enzymes Producing Psychrotrophic Bacteria from Soil of Jammu City. Biosci. Biotech. Research. Asia. 10(1):267-273.
Marana, S.R. 2012. Structural and mechanistic fundamentals for designing of cellulase.
Comput. Struct. Biotech. J. 2(3).
Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R, Mattiasson B (2000). Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains. J. Biotechnol.
83:177-187.
Miranda, M., T.L. Kam, Q. Wensheng. 2009. The prospects of cellulase producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. Int. J. Biol. Sci. 5:500- 516.
Misson, M., R. Haron, M.F.A. Kamaroddin and N.A.S. Amin. 2009. Pretreatment empty palm fruit bunch for lignin degradation. J. Technol. 50:89-98.
Morag, E., I. Halevy, E.A. Bayer and R. Lamed. 1991. Isolation and Properties of a Major Cellobiohydrolase from the Cellulosome of Clostridium thermocellum. J. Bacteriol. 173(13):4155-4162.
Navya, P.N., N. Roopali and S. Murthy. 2012. Bioconversion of Coffee Husk Cellulose and Statistical Optimization of Process for Production of Exoglucanase by Rhizopus stolonifer. Academic J. Plant. Sci. 20(6):781-789.
Nelson, N. 1944. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem. 153:375–380.
Nelson, D.L. and M.M. Cox. 2005. Enzyme. In Lehninger Principles of Biochemistry, New York: W.H. Freeman, pp.190-213
Nyanhongo, G.S., M. Schroeder, W. Steiner and G.M. Gubitz. 2005. Biodegradation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT): An enzymatic perspective. Biocatal. Biotransfor.
23(2):53-69.
Nutt, A., 2006. Hydrolytic and oxidative mechanism involved in cellulose degradation. Acta Universitatis Upsaliensis. Digital Comprehensive Summaries of Upsala Dissertations from the Faculty of Science and Technolog, Uppsala, p.9-15.
Ornstein, L. 1964. Discontinuous electrophoresis. Ann. N.Y. Acad. Sci, pp.321-349. Ozaki, K. and S. Ito. 1991. Purification and properties of an acid endo-1,4-β-glucanase
from Bacillus sp. KSM-330. J. General Microb. 137:41-48.
Pason, P., K.L. Kyu and K. Ratanakhanokchai. 2006. Paenibacillus curdlanolyticus
Strain B-6 Xylanolytic-Cellulolytic Enzyme System That Degrades Insoluble Polysaccharides. Appl. Environ. Microb. 72(4):2483-2490. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rizwan H. K., Sheeba R and Soghra K. H. 2003. Effect of pH, temperature and alcohols on the stability of glycosylated and deglycosylated stem bromelain. J. Biosci. 28(6):709-714.
Ryckeboer, J., J. Megaert, J. Coosemans, K. Deprins and J. Swings. 2003. Microbiological aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin. J. Appl. Microbiol. 94:127-137.
Sakata, M., H. Ooshima and Y. Harano. 1985. Effects of agitation on enzymatic saccharification of cellulose. Biotechnol Lett. 7:689 – 694.
Saleem, M., M. S. Akhta, R. Yasmin, M. Zahid, N. N. Malik, M. Afzal and M. I. Rajoka. 2008. Production, purification and characterization of β-1,4- endoglucanase from a novel bacterial strain CTP-09 of a Bacillus sp. Protein and Peptide letters 15:402-410.
Sandgren, M., M. Wu, S. Karkehabadi, C. Mitchinson, B.R. Kelemen, E.A. Larenas, J. Stahlberg and H. Hansson. 2013. The Structure of a Bacterial Cellobiohydrolase: The Catalytic Core of the Thermobifica fusca Family GH6 Cellobiohydrolase Cel6B. J. Mol. Biol. 425(3):622-635.
Sasidharan, S., S. Sajith and S. Benjamin. 2013. Cellulase Producing Bacteria from the Wood-Yards on Kallai River Bank. Adv. Microb. 3:326-332.
Scopes, R.K. 1994. Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edition, New York-Berlin-Heidelberg-London-Paris-Tokyo-Hong Kong-Barcelona-Budapest: Springer-Verlag, pp. 102-119.
Scopes, R.K. 1994. Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edition, New York-Berlin-Heidelberg-London-Paris-Tokyo-Hong Kong-Barcelona-Budapest: Springer-Verlag, pp. 146-171.
Scopes, R.K. 1994. Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edition, New York-Berlin-Heidelberg-London-Paris-Tokyo-Hong Kong-Barcelona-Budapest: Springer-Verlag, pp. 238-249.
Scopes, R.K. 1994. Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edition, New York-Berlin-Heidelberg-London-Paris-Tokyo-Hong Kong-Barcelona-Budapest: Springer-Verlag, pp. 293-307.
Singh, A., R.C. Kuhad and O.P. Ward. 2007. Industrial application of microbial cellulases, in Lignocellulose Biotechnologgy: Future Prospects. 345-358.
Spain, J.C. 1995. Biodegradation of nitroaromatic compounds. Microbiol. 49:523-555. Sudan R, Bajaj BK (2007). Production and biochemical characterization of xylanase
from an alkalitolerant novel sp Aspergillus niveus RS2. World. J. Microbiol. Biotechnol. 23:491-500.
Sukuraman, R.K., R.R. Singhania and A. Pandey. 2005. Microbial cellulase- production, applications and challenges. J. Sci. Ind. Res. India. 62(11):832-844. Tambekar, D.H., P.N. Dose, S.R. Gunjakar and P.V. Gadakh. 2012. Studies on
Biosurfactant production from Lonar’s lake Achromobacter xylosoxidans
bacterium. Int. J. Adv. Pharm. Biol. 1(3):415-419.
Teather, R and P.T. Wood. 1981. Use the Congo Red-Polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from Bovine rumen.
Appl. Environ. Microbiol. 43:777-780.