Sắc ký là quá trình phân tách các chất trong hỗn hợp (khí hoặc lỏng) gồm nhiều chất khác nhau. Phương pháp này được giới thiệu lần đầu vào những năm đầu 1900 bởi Mikhail Tsvet. Trong sắc ký người ta phân biệt pha tính và pha động. Theo đó, pha tĩnh là chất lỏng hoặc các hạt nhỏ có mang điện tích được nhồi vào trong cột có tác dụng giữ vật chất lại và có khả năng thay đổi điện tích. Pha động là chất lỏng hoặc khí chảy qua cột chứa pha tĩnh theo một hướng nhất định có tác dụng kéo các chất cần phân tích ra. Nguyên tắc cơ bản của sắc ký là dựa vào sự khác biệt về ái lực giữa các cấu tử đối với pha tĩnh, pha động di chuyển với tốc độ khác nhau sẽ giúp phân tách các chất ra (Scopes, 1994).
Định nghĩa của IUPAC (1993): “Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử cần phân tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định”.
Một số phương pháp sắc ký thường được sử dụng là sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký tương tác kị nước...
Sắc ký trao đổi ion
a. Khái niệm
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích của protein trong dung dịch. Nói cách khác, phương pháp này phân tách protein dựa vào tương tác trao đổi ion giữa protein trong dung dịch (nước, dung dịch đệm) (pha động) và các tác
nhân trao đổi ion (pha tĩnh). Tác nhân trao đổi ion là những chất trơ, không tan trong nước có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có dạng lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystirol (Scopes, 1994).
b. Nguyên lý
Protein có cấu trúc gồm các gốc mang điện tích trên bề mặt, tùy vào pH môi trường và điểm đẳng điện pI mà chúng có thể tích điện dương hay âm. Nếu pH < pI thì protein tích điện dương, nếu pH > pI thì protein tích điện âm, đây là cơ sở quan trọng để lựa chọn loại gel thích hợp cho từng loại protein. Có 2 loại gel trao đổi ion (Hình 10)
+ Gel trao đổi ion âm: các nhóm chức mang điện tích dương tương tác trao đổi ion âm với protein mang điện tích âm
+ Gel trao đổi ion dương: các nhóm chức mang điện tích âm tương tác trao đổi ion dương với các protein mang điện tích dương.
Hình 10. Hai loại hạt gel dùng trong sắc ký trao đổi ion
(*Nguồn: http://www.waters.com/waters/en_US/HPLC-Separation- Modes/nav.htm?cid=10049076&locale=en_US ngày 25/5/2014)
Trong quá trình sắc ký, các phân tử protein sẽ tạo liên kết ion thuận nghịch với pha tĩnh. Các protein không bám sẽ đi ra trước, các protein bám sẽ được giữ lại trên pha tĩnh và sau đó được rửa giải từ từ bằng cách dùng nồng độ muối hoặc thay đổi pH. Có 2 cách rửa giải là rửa giải theo chiều gradient liên tục (continuous gradient) hoặc rửa giải từng bước (stepwise). Thứ tự protein được rửa giải sẽ tùy theo điện tích protein mạnh hay yếu. Sau đó ta sẽ thiết lập một biểu đồ thể hiện sự tương tác giữa protein và mang chất mang, thông qua đó ta sẽ chọn ra những phân đoạn nào chứa protein cần thiết (Janson Rydén, 1998).
Hình 11. Sắc ký trao đổi ion
(*Nguồn: Nelson và Cox, 2005)
Hình 12. Biểu đồ hấp thụ điện tích protein trong sắc ký trao đổi ion
(*Nguồn: Janson và Ryden, 1998)