b. Định lượng hoạt tính bằng phương pháp Nelso n Somogyi
2.4.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.4.1. Trong nước
Trong nước hầu như là chưa có một báo cáo nào về tinh sạch enzyme cellulase từ vi khuẩn Achromobacter nói riêng và vi khuẩn nói chung, chủ yếu tinh sạch cellulase là tập trung vào đối tượng nấm. Tuy nhiên có một số nghiên cứu về đặc tính hệ enzyme của vi khuẩn Achromobacter đã được ghi nhận. Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự (2009) nghiên cứu về khả năng phân hủy chất 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) từ một số chủng vi khuẩn trong đó có Achromobacter xylosoxidans. Kết quả cho thấy sau 5 ngày nuôi lắc với nồng độ TNT ban đầu là 100 ppm, vi khuẩn A. xylosoxidans loại bỏ được 99.35% TNT. Bài báo cũng đề cập đến một số enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa như lignin peroxidase, manganese peroxidase, laccase giúp khoáng hóa rồi chuyển hóa hoàn toàn TNT. Các enzyme này tham gia vào các chu trình phân hủy các hợp chất vòng có cấu trúc tương tự lignin.
Phạm Thị Thanh Hà và cộng sự (2003) có báo cáo về nghiên cứu phân giải phosphate vô cơ với một số chủng vi khuẩn trong đó có vi khuẩn Achromobacter sp. được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ muối từ 0 – 5%. Theo đó, 3 dòng vi khuẩn
Achromobacter sp. được sử dụng đều cho thấy có khả năng phát triển ở nồng độ muối từ 0 - 2%. Bên cạnh đó, lượng phosphate khó tan được phân giải bởi 3 dòng vi khuẩn này cao nhất đạt từ 500 – 600 (g/l).
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh Như và cộng sự (2013) đã cho thấy khả năng tổng hợp chất kích thích tăng trưởng Indole Acetic Acid (IAA) và cố định đạm của một loại vi khuẩn được phân lập từ rễ chuối vùng đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả giải mã cho thấy vi khuẩn này đồng hình đến 97% với vi khuẩn Achromobacter sp.
Một số các nghiên cứu khác cũng cho thấy tính đa dạng hệ enzyme từ vi khuẩn A. xylosoxidans. Enyme từ vi khuẩn này có khả năng phân giải carbazol trong môi trường nhiễm dioxin với sự có mặt các hợp chất như naphthalene và phenanthrene (Nguyễn Thị Hạnh và cộng sự, 2009). Các hợp chất nitrogen dưới dạng NO3-, NO2- cũng được phân hủy bởi hệ enzyme của nhóm vi khuẩn A. xylosoxidans (Nguyễn Văn Cách, 2010)
2.4.2. Ngoài nước
Cho đến nay các báo cáo về tinh sạch enzyme endoglucanase từ vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans hầu như là chưa có ngay cả trên thế giới. Theo báo cáo Sesidharan Sreedevi et al. (2013) thì 3 dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans
BSS4, Bacillus sp. BSS3 và Pseudomonas sp. BSS2 đều có khả năng sản xuất cellulase với cơ chất basal salt medium (BSM) cộng thêm 0.5% CMC. Bên cạnh đó, bài báo cũng có đề cập một số các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến enzyme cellulase như nhiệt độ, pH cũng như nồng độ CMC. Theo đó, nhiệt độ tối ưu để sản sinh cellulase của A. xylosoxidans BSS4 là 40oC, pH là 7 và 0.5% CMC.
Có một số bài báo cũng đề cập đến khả năng sản sinh cellulase ngoại bào từ chủng vi khuẩn Achromobacter (Chawla et al., 2008). Điều này càng được củng cố thêm bởi báo cáo của Maharana và Ray (2013) cũng cho biết chủng vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans có khả năng sản sinh endoglucanase ngoại bào. Enzyme protease cũng đã từng được trích ly từ vi khuẩn Achromobacter lyticus M497-1 và khảo sát một số đặc điểm (Masaki et al. 1986)
Bên cạnh đó, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans cũng cho thấy tiềm năng đối với quá trình xử lý các chất thải môi trường. Theo báo cáo của Tambekar et al. (2012) cho thấy A. xylosoxidans được phân lập từ hồ Lonar ở Maharashtra-Ấn Độ có khả năng sản sinh hợp chất sinh học có khả năng hoạt động bề mặt giúp khắc phục ô nhiễm dầu mỏ. Kết quả cho thấy thời gian ủ tỉ lệ thuận với lượng dầu mỏ được phân hủy và ở thời gian ủ 98 giờ, lượng dầu mỏ bị phân hủy đạt 28,3%.
Nghiên cứu của Konoshit et al. (1975) chứng minh rằng dòng vi khuẩn
Achromobacter guttatus KI72 có khả năng sử dụng hợp chất vòng dimer aminocaproic acid như là nguồn carbon và nitơ từ bùn, và có thể tổng hợp nylon mạch ngắn oligomer với độ dài phân tử trong khoảng ɛ-aminocaproic tới hexamer.
Dù chưa có nhiều báo cáo về tinh sạch enzyme cellulase từ A. xylosoxidans, tuy nhiên với những tính chất đã nêu, cho thấy việc tinh sạch cellulase từ vi khuẩn này là điều khả thi.
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian từ tháng 6/2014 đến tháng 12/2014
Địa điểm: Phòng Công nghệ Enzyme, Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học thuộc trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên, vật liệu
Dòng vi khuẩn BM13 đồng hình ở mức 91% với dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13 (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012) được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Bã mía được rửa bằng nước máy đến khi nước rửa trong không còn bụi bẩn, sấy khô đến khối lượng không đổi, nghiền mịn bằng lưới có kích thước đường kính 0,2mm và được xử lý loại bỏ lignin (Phụ lục 1).
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị sử dụng bao gồm: Hệ thống điện di Mini protean (Bio Rad), tủ ủ vi sinh vật Memmert, tủ cấy vô trùng Esco, hệ thống sắc ký (Bio Rad), máy đo quang phổ, máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417R, máy lắc ủ Eppendorf (Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-International (Đức), bếp đun cách thủy Prolabo, tủ lạnh 4oC, -20oC và một số thiết bị khác.
Các dụng cụ sử dụng bao gồm đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc thủy tinh, cốc nhựa, chai lọ thủy tinh, các ống eppendorf, bộ micropipet Bio Rad và một số dụng cụ khác.
3.1.4. Hóa chất
- Acetone (Sigma), Natri clorua (NaCl) (Sigma), Magnesium heptasulfate (MgSO4.7H2O) (Pháp), Dipotassium hydrogenphosphate (K2HPO4) (Sigma), Monopotassium dihydrogenphosphate (KH2PO4) (Sigma), Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) (Sigma), Bovin Serum Albumin (Merck), Tris-HCl, β-mercaptoethanol, Acrylamide (Bio Rad), Sodium hydroxide (NaOH) (Sigma), Sodium Dodecyl Sulfate (C12H25NaO4S) (Merck), Bromophenol Blue, Acetic acid (CH3COOH) (Sigma), Hydrochloric acid (HCl) (Sigma), thuốc thử đồng, thuốc thử Aseno Moblybdate, thuốc
thử Bradford, Glucose (Merck), Glycerol (Merck), Commassie Brilliant Blue R250 (Pháp), Glycine (Merck), Methanol (CH3OH) (Sigma), Ethanol (C2H5OH) (Sigma), Ammonium persulfate (Sigma), Carboxy Methylcellulose (Sigma), EDTA (Merck), Tetramethylethylenediamine, yeast extract (Ấn Độ)
- Gel sắc ký: Uno Sphere Q
3.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường đặc Ryckeboer et al. (2003) cải tiến
Bảng 1: Thành phần môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn (M1)
Tên hóa chất Khối lượng/Thể tích Đơn vị
Bột bã mía 10 Gram (NH4)2SO4 1 Gram K2HPO4 1 Gram MgSO4.7H2O 0,5 Gram NaCl 0,001 Gram Agar 20 Gram Nước 1000 ml
(*Nguồn: Ryckeboer et al. (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al. (2010))
Môi trường lỏng Ryckeboer et al. (2003) cải tiến
Bảng 2: Thành phần môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn (M2)
Tên hóa chất Khối lượng/Thể tích Đơn vị
Bột bã mía 10 Gram (NH4)2SO4 1 Gram K2HPO4 1 Gram MgSO4.7H2O 0,5 Gram NaCl 0,001 Gram Nước 1000 ml
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate ammonium sulfate
Muc đích thí nghiệm: Xác định hàm lượng ammonium sulfate cần thiết để kết tủa endoglucanase có hoạt tính cao nhất
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị dịch enzyme thô: chủng 1% dịch vi khuẩn (mật số khoảng 107
CFU/ml) vào 700ml môi trường lỏng (Ryckeboer, 2003) cải tiến bằng cơ chất bã mía (Bùi Thị Thiên Thanh, 2010), ủ kị khí trong 5 ngày ở 38oC.
- Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được ly tâm với tốc độ 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC. Mục đích để bước đầu thu dịch enzyme thô
- Dịch enzyme thô tiếp tục được tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate với các nồng độ bão hòa lần lượt là 50%, 60%, 70%, 80% và 90% ở 4oC trong vòng 1 giờ. Kết tủa ở mỗi phân đoạn được thu nhận bằng cách ly tâm 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC. Enzyme thu được được sau ly tâm được hòa tan trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,05M (pH 7,5), sau đó thẩm tích tiếp trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,05M (pH 7,5) trong 24 giờ ở 4oC.
- Dịch enzyme thô ở mỗi phân đoạn sau thẩm tích được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại khi đánh giá chỉ tiêu
Chỉ tiêu đánh giá
- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1)
- Xác định phần trăm hoạt lực endoglucanase bằng lượng CMC bị thủy phân (độ nhớt) (Phụ lục 1)
- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1) - Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)
3.2.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol
Muc đích: Xác định lượng ethanol cần thiết để kết tủa endoglucanase có hoạt tính cao nhất
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị dịch enzyme thô: chủng 1% dịch vi khuẩn (mật số khoảng 107 CFU/ml) vào 600 ml môi trường lỏng (Ryckeboer, 2003) cải tiến bằng cơ chất bã mía (Bùi Thị Thiên Thanh, 2010), ủ kị khí trong 5 ngày ở 38oC.
- Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được ly tâm với tốc độ 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC. Mục đích để bước đầu thu dịch enzyme thô
- Dịch enzyme thô được chia làm 4 phần bằng nhau (mỗi phần 150 ml), mỗi phần được dùng để tủa với ethanol với các tỉ lệ lần lượt là 1:1; 1:2; 1:3; 1:4
- Quá trình tủa như sau
1. Ethanol (1,5 lít) được làm lạnh và trữ ở 4oC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Cho mỗi phần enzyme thô vào 1 ống và cho ethanol (4oC) vào các ống ly tâm với các tỉ lệ tương ứng (1:1; 1:2; 1:3; 1:4)
3. Ủ các ống trong nước đá trong vòng 60 phút
4. Ly tâm các ống với tốc độ 6.000 rpm ở 4oC trong vòng 20 phút 5. Phần cặn lắng được hòa tan trong Tris-HCl 0,05M (pH 7,5)
Chỉ tiêu đánh giá
- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1) - Xác định phần trăm hoạt lực endoglucanase (Phụ lục 1)
- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1) - Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)
3.2.3. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với acetone
Muc đích: Xác định lượng acetone cần thiết để kết tủa endoglucanase có hoạt tính cao nhất
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị dịch enzyme thô: chủng 1% dịch vi khuẩn (mật số khoảng 107 CFU/ml) vào 600 ml môi trường lỏng (Ryckeboer, 2003) cải tiến bằng cơ chất bã mía (Bùi Thị Thiên Thanh, 2010), ủ kị khí trong 5 ngày ở 38oC.
- Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được ly tâm với tốc độ 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC.
- Mỗi 150ml dịch enzyme thô được dùng để tủa với acetone với các tỉ lệ lần lượt là 1:1; 1:2; 1:3; 1:4
- Quá trình tủa như sau
1. Acetone (1,5 lít) được làm lạnh và trữ ở -20oC
2. Cho mỗi phần enzyme thô vào 1 ống và cho acetone (-20oC) vào các ống ly tâm với các tỉ lệ tương ứng (1:1; 1:2; 1:3; 1:4)
3. Ủ các ống trong nước đá trong vòng 60 phút
4. Ly tâm các ống với tốc độ 6.000 rpm ở 4oC trong vòng 20 phút
5. Phần cặn lắng được hòa tan bằng dung dịch đệm Tris-HCl 0,05M (pH 7,5)
Chỉ tiêu đánh giá
- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1) - Xác định phân trăm hoạt lực endoglucanase (Phụ lục 1)
- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1) - Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)
3.2.4. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion
Mục đích: Tách endoglucanase ra khỏi các tạp chất khác dựa vào điện tích bề mặt của protein.
Tiến hành thí nghiệm:
a. Chuẩn bị gel: Cân 10 gram gel Uno Sphere Q cho vào cốc chứa dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5) ngâm 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng, rửa gel bằng dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5). Lặp lại quá trình rửa 2 lần.
b. Nhồi gel vào cột: Nhồi gel vào cột sắc ký (2,5x10cm). Cân bằng cột bằng 60ml dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5) (3 lần thể tích cột). Tốc độ dòng chảy 1ml/phút.
c. Bơm mẫu: 20ml dung dịch protein được xác định hoạt tính cao nhất ở 1 trong 3 thí nghiệm trên được bơm vào cột với tốc độ 1ml/phút.
d. Rửa cột: Cột được rửa bằng dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5), theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ đến khi protein không bám được đẩy ra hết khỏi cột. Tốc độ dòng chảy là 1ml/phút.
e. Rửa giải: Rửa giải bằng gradient nồng độ muối NaCl từ 0-1M, trong dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5), tốc độ dòng chảy 1ml/phút.
Mỗi phân đoạn được tiến hành thẩm tích trong dung dịch đệm Tris-HCl (0,05M, pH 7,5) trong 24 giờ ở 4oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chỉ tiêu đánh giá:
- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1)
- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1) - Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)
- Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE (Phụ lục 1)
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate sulfate
Kết quả quá trình tủa enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn với muối ammonium sulfate được thể hiện trong bảng sau
Bảng 3: Tổng kết quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate
Phân đoạn Thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Dịch thô 700 28,2 ± 1,80 985 ± 196 34,9 Phân đoạn 50% 10,4 4,36 ± 0,185 163 ± 33,8 37,3 Phân đoạn 60% 13,5 1,43 ± 0,180 197 ± 71,8 137 Phân đoạn 70% 11,1 0,977 ± 0,022 137 ± 37,6 140 Phân đoạn 80% 14 0,616 ± 0,065 176 ± 50,3 286 Phân đoạn 90% 19 0,510 ± 0,069 18,3 ± 6,79 35,9
Bảng 3 cho thấy hàm lượng protein tổng của mẫu enzyme thô là 28,2 mg nhưng sau khi trải qua quá trình tinh sạch bằng AS, tổng lượng protein thu lại được chỉ là 7,893 mg. Qua đó cho thấy một lượng lớn protein đã bị thất thoát sau quá trình tinh sạch. Nguyên nhân có thể là do thời gian để kết tủa protein chưa đủ nên đa phần protein vẫn chưa được kết tủa và còn tồn tại trong dung dịch.
Qua bảng 3 có thể thấy sau quá trình tủa phân đoạn với AS, hoạt tính đặc hiệu tăng dần từ nồng độ AS 50% đến nồng độ 80% và giảm mạnh xuống ở nồng độ AS 90%. Ở phân đoạn nồng độ 50%, protein tổng thu được là cao nhất tuy nhiên hoạt tính ở phân đoạn này không cao nên hoạt tính đặc hiệu gần như tương đương với mẫu enzyme thô chưa qua tinh sạch (lần lượt là 37,3 và 34,9 U/mg). Điều này cho thấy ở phân đoạn 50%, một số protein không phải protein mục tiêu đã bị tủa xuống. Ở phân đoạn 60% AS, hoạt tính tổng thu được là cao nhất (196,5 mg) nhưng hoạt tính đặc hiệu chưa phải là cao nhất (137,4 U). Mặc dù vậy, điều đó cho thấy có khả năng endoglucanase có thể bắt đầu được tinh sạch từ giai đoạn này. Từ 50 – 80% AS, hoạt tính đặc hiệu tăng lên rất cao xấp xỉ 8 lần. Ở phân đoạn 80% AS, mặc dù protein tổng thu được khá thấp (0,616 mg) nhưng hoạt tính tổng ở phân đoạn này rất cao (176,3 U). Điều đó cho thấy endoglucanase có thể tủa hiệu quả ở phân đoạn này. Ở 90% AS thì
đồng loạt protein và hoạt tính tổng giảm xuống đáng kể (lần lượt là 0,51 mg và 18,3 U) dẫn đến hoạt tính đặc hiệu giảm mạnh xuống xấp xỉ 4 lần (89,9 U/mg) so với phân đoạn 80% AS. Qua đó cho thấy enzyme này có thể được tinh sạch từ phân đoạn 50 – 80% AS, ở 90% mặc dù có hoạt tính đặc hiệu nhưng số liệu không cao và nguyên nhân có thể là do lượng enzyme còn sót lại trong mẫu chưa được thu triệt để từ các phân đoạn trước đó.
Hoạt tính các phân đoạn tủa với ammonium sulfate còn được khảo sát bằng phương pháp đo độ nhớt của dung dịch CMC sau phản ứng enzyme với cơ chất. Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình sau.
Hình 14. Hoạt tính giữa các phân đoạn tủa với AS bằng phản ứng thủy phân cơ chất CMC
*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng kí tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; CV = 5,28%
Kết quả trên cho thấy endoglucanase thể hiện hoạt tính ở các phân đoạn hầu hết đều khác nhau có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và đều cao hơn mẫu enzyme thô. Trong đó, hoạt tính cao nhất ở phân đoạn 80% với 0,45% cơ chất bị thủy phân, điều này cũng phù hợp với kết quả tinh sạch ở bảng 4. Ở phân đoạn 60% cho kết quả thủy phân cao hơn phân đoạn 70% (lần lượt là 0,36% và 0,33%) và khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Điều này có thể hiểu được là mặc dù hoạt tính đặc hiệu ở 2 phân đoạn là tương đương nhau (137,4 U và 140,1 U) nhưng ở phân đoạn 60% lượng protein tổng