Hĩa chất và thuốc thử

2. Tên đề tà

2.1.1 Hĩa chất và thuốc thử

 Enrofloxacin (chuẩn)  Norfloxacin (chuẩn)  Marbofloxacin (chuẩn)  Dung dịch NaOH 0,1 N  Nước cất, nước RO 2.1.2Dụng cụ và thiết bị

 Cân phân tích – CP 224S Sartorius  Bể siêu âm – 1510 Branson

 Quang phổ kế UV-Vis Ultrospec 2000 Pharmacia

 Bình định mức, pipet, cuvet thạch anh đạt cấp chính xác loại A

2.2

Đầu tiên, tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của của độ hấp thu (Abs) vào bước sĩng () và nồng độ đối với Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin. Sau đĩ tiến hành các thí nghiệm về thẩm định phương pháp và thực hiện các thí nghiệm xác định mức độ nhiễm chéo trên mẫu thật.

2.3

2.3.1Thí nghiệm về khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thu theo nồng độ

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phụ thuộc của Abs theo  của mẫu trắng

a) Mục đích:

Xác định sự ảnh hưởng của mẫu trắng đối với chất khảo sát.

b) Nội dung:

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:23

Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phụ thuộc của Abs theo  đối với Enrofloxacin,

Norfloxacin và Marbofloxacin

a) Mục đích:

Xác định bước sĩng mà tại đĩ Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin cĩ độ hấp thu cực đại (max)

b) Nội dung:

– Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin. – Tiến hành quét phổ trên máy quang phổ UV-Vis.

– Từ kết quả thu được, xác định max của mỗi chất.

Thí nghiệm 3: Khảo sát sự phụ thuộc Abs theo nồng độ đối với Enrofloxacin,

Norfloxacin và Marbofloxacin

a) Mục đích:

Khảo sát khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin.

b) Nội dung:

 Tạo dãy dung dịch chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin với các nồng độ khác nhau và tiến hành đo trên máy quang phổ UV-Vis tại max của mỗi chất.

 Từ kết quả thu được, xác định sự phụ thuộc của Abs theo nồng độ của mỗi chất

2.3.2Thí nghiệm về thẩm định phương pháp

2.3.2.1 Độ chọn lọc

Thí nghiệm 4: Đánh giá độ chọn lọc của kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương

pháp quang phổ

a) Mục đích:

Đánh giá mức độ chọn lọc của kỹ thuật thêm chuẩn trên áp dụng trên phương pháp quang phổ.

b) Nội dung:

– Tạo các mẫu đơn thành phần cĩ hàm lượng biết trước (chọn Enrofloxacin để thực hiện thí nghiệm).

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:24

– Tạo mẫu đơn thành phần của chất cĩ khả năng gây nhiễu (chọn thành phần gây nhiễu là Norfloxacin).

– Tạo mẫu đa thành phần gồm Enrofloxacin và Norfloxacin cĩ hàm lượng Enrofloxacin biết trước tương tự trong mẫu đơn.

– Đo phổ của các mẫu trên và rút ra nhận xét.

2.3.2.2Độ đúng

Thí nghiệm 5: Đánh giá độ đúng của kỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang

phổ

a) Mục đích:

Đánh giá độ đúng của kỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang phổ dựa vào giá trị độ tìm lại Rc.

b) Nội dung:

– Chuẩn bị mẫu của một chất khảo sát cĩ hàm lượng biết trước (chọn Enrofloxacin) . – Tạo dãy mẫu thêm chuẩn và đo tín hiệu phân tích bằng máy quang phổ UV-Vis. – Xác định độ đúng của kết quả, yêu cầu đặt ra: 95% ≤ Rc ≤ 105%.

2.3.2.3Độ lặp lại

Thí nghiệm 6: Đánh giá độ lặp lại của kỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang

phổ

a) Mục đích:

Đánh giá độ lặp lại của kỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang phổ dựa trên độ lệch chuẩn tương đối RSD.

b) Nội dung:

 Chuẩn bị các mẫu Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin cĩ hàm lượng biết trước.

 Tạo dãy mẫu thêm chuẩn và đo tín hiệu phân tích trên máy quang phổ UV-Vis đối với các mẫu trên.

 Lặp lại các thao tác thí nghiệm như trên 6 lần.

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:25

2.3.2.4 Độ tuyến tính

a) Mục đích:

Xác định độ tuyến tính của Abs và nồng độ đối với kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ. Đánh giá dựa vào hệ số tương quan R và hàm số tương quann tuyến tính Abs = a.C + b.

b) Nội dung:

 Dựa vào các kết quả của thí nghiệm 3, xác định khoảng tuyến tính của Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin. Khoảng tuyến tính phải thõa điều kiện R > 0,9990.

 Tìm phương trình hồi quy tuyến tính của mỗi chất.

2.3.2.5Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

a) Mục đích:

Xác định Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp.

b) Nội dung:

Dựa vào kết quả thí nghiệm 3 và thí nghiệm 6, tính tốn LOD và LOQ theo cơng thức đã nêu ở mục 1.5.3.6.

2.3.3Áp dụng phương pháp trên mẫu thật

Thí nghiệm 7: Xác định mức độ nhiễm chéo Enrofloxacin trong bồn trộn VMDX1068

a) Thực hiện:

 Bồn trộn mã số VMDX1068 sau khi trộn mẻ thuốc VIMENRO concentrated cĩ

chứa hàm lượng Enrofloxacin 50% được vệ sinh sạch.  Tráng kỹ bồn bằng 25 kg tá dược trơ lactose.

 Định lượng Enrofloxacin trong tá dược tráng bồn.

b) Kết quả:

 Tính lượng Enrofloxacin cịn tồn dư và so sánh với yêu cầu đặt ra.

 Yêu cầu: hàm lượng Enrofloxacin tồn dư trong tá dược tráng bồn phải thấp hơn 10 mg/kg tá dược.

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:26

Thí nghiệm 8: Xác định mức độ nhiễm chéo Enrofloxacin trong bồn trộn VMD1078

Thực hiện và tính tốn tương tự thí nghiệm 7 nhưng áp dụng với mẫu từ bồ trộn VMD1078 sau khi trộn mẻ thuốc VIMENRO chứa hàm lượng Enrofloxacin 10%.

Thí nghiệm 9: Xác định mức độ nhiễm chéo Norfloxacin trong bồn trộn VMD1070

a) Thực hiện:

 Bồn trộn mã số VMDX1070 sau khi trộn mẻ thuốc NORFLOXACIN 50 cĩ chứa

hàm lượng Norfloxacin 50% được vệ sinh sạch.  Tráng kỹ bồn bằng 25 kg tá dược trơ lactose.  Định lượng Norfloxacin trong tá dược tráng bồn.

b) Kết quả:

 Tính lượng Norfloxacin cịn tồn dư và so sánh với yêu cầu đặt ra.

 Yêu cầu: hàm lượng Chloramphenicol tồn dư trong tá dược tráng bồn phải thấp hơn 10mg/kg tá dược.

Thí nghiệm 10: Xác định mức độ nhiễm chéo Marbofloxacin trong bồn trộn

VMD1077

a) Thực hiện:

 Bồn trộn mã số VMDX1077 sau khi trộn mẻ thuốc MARBO VIRYL ONE cĩ chứa hàm lượng Marbofloxacin 20% được vệ sinh sạch.

 Tráng kỹ bồn bằng 25 kg tá dược trơ lactose.

 Định lượng Marbofloxacin trong tá dược tráng bồn.

b) Kết quả:

 Tính lượng Marbofloxacin cịn tồn dư và so sánh với yêu cầu đặt ra.

 Yêu cầu: hàm lượng Marbofloxacin tồn dư trong tá dược tráng bồn phải thấp hơn 10 mg/kg tá dược lactose.

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:27

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1

Thí nghiệm 1: Khảo sát Abs theo của mẫu trắng

a) Thực hiện:

 Chuẩn bị mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,1N  Quét phổ:

+ Set-ref: 271 nm

+ Cốc so sánh là cốc rỗng

+ Quét trong khoảng từ 190 nm – 1100 nm.

b) Kết quả:

Hình 3-1: Kết quả quét phổ của dung dịch NaOH 0,1 N

c) Nhận xét:

 Ở vùng bước sĩng từ 250 nm – 850 nm: Mẫu trắng NaOH gần như khơng hấp thu quang phổ.

 Chọn cốc so sánh là NaOH 0,1N cho các thí nghiệm về sau đối với ba chất khảo sát.

Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phụ thuộc của Abs theo  đối với Enrofloxacin,

Norfloxacin và Marbofloxacin

a) Thực hiện:

Chuẩn bị mẫu chuẩn:

 Enrofloxacin: cân 100 mg chất chuẩn Enrofloxacin, cho vào BĐM 100 ml, pha lỗng 1/50.

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:28

 Marbofloxacin: chuẩn bị tương tự Enrofloxacin.

Quét phổ:

Bảng 3-1: Điều kiệ n quét phổ thí nghiệ m khảo sát sự phụ thuộc của Abs theo 

Enrofloxacin Norfloxacin Marbofloxacin

Dung mơi NaOH 0,1N

Cốc so sánh NaOH 0,1N

Set-ref  = 271 nm  =273 nm  = 290 nm

Khoảng quét phổ Trong khoảng 190 nm – 1100 nm

b) Kết quả:

Hình 3-2: Kết quả quét phổ của Enrofloxacin

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:29

Hình 3-4: Kết quả quét phổ của Marbofloxacin

c) Nhận xét:

 Với Enrofloxacin:

 Dung dịch cĩ hấp thu cực đại ở  = 271 nm (max = 271 nm).

 Chọn max = 271 nm làm giá trị để set-ref cho các thí nghiệm về sau.  Với Norfloxacin:

 Dung dịch cĩ hấp thu cực đại ở  = 273 nm (max = 273 nm).

 Chọn max = 273 nm làm giá trị để set-ref cho các thí nghiệm về sau.  Với Marbofloxacin:

 Dung dịch cĩ hấp thu cực đại ở  = 290 nm (max = 290 nm).

 Chọn max = 290 nm làm giá trị để set-ref cho các thí nghiệm về sau.

Thí nghiệm 3: Khảo sát sự phụ thuộc Abs theo nồng độ đối với Enrofloxacin,

Norfloxacin và Marbofloxacin

a) Thực hiện:

– Chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩn Enrofloxacin:

Cân 103,9 mg chất chuẩn Enrofloxacin, cho vào BĐM 100 mL thêm dung dịch NaOH 0,1 M đến vạch.

Tạo dãy mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau như bảng 3-2. – Chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩn Norfloxacin:

Cân 111,7 mg Norfloxacin, cho vào BĐM 100 mL thêm nước cất đến vạch. Tạo dãy mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau như bảng 3-2.

– Chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩnMarbofloxacin:

Cân 112,8 mg Marbofloxacin, cho vào BĐM 100 mL thêm nước cất đến vạch. Tạo dãy mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau như bảng 3-2.

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:30

Bảng 3-2: Xây dựng dãy chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin

Chất Dãy chuẩn ^{Nồng độ (mg/L)} 1 2 3 4 5 ER 0,05 mg/L – 1 mg/L 0,052 0,104 0,260 0,520 1,039 1 mg/L – 5 mg/L 1,039 2,078 3,117 4,156 5,195 5 mg/L – 25 mg/L 5,195 10,390 15,585 20,780 25,975 NL 0,05 mg/L – 1 mg/L _{0,056 0,112 0,279 0,559 1,117} 1 mg/L – 5 mg/L 1,117 2,234 3,351 4,468 5,585 5 mg/L – 25 mg/L 5,585 11,170 16,755 22,34 27,925 MB 0,05 mg/L – 1 mg/L _{0,056 0,113 0,282 0,564 1,128} 1 mg/L – 5 mg/L 1,128 2,256 3,384 4,512 5,64 5 mg/L – 25 mg/L _{5,640 11,280 16,920 22,560 28,200} – Đo trên máy quang phổ:

Bảng 3-3: Điề u kiệ n quét phổ

Enrofloxacin Norfloxacin Marbofloxacin

Dung mơi NaOH 0,1N

Cốc so sánh NaOH 0,1N

Set-ref  = 271 nm  =273 nm  = 290 nm

Khoảng quét phổ 190 nm – 450 nm 190 nm – 450 nm 190nm – 450 nm

Cốc đo Các cốc từ 1 -5

– Vẽ đồ thị và xác định sự phụ thuộc của độ hấp thu theo nồng độ của mỗi chất.

b) Kết quả:

Bảng 3-4: Kết quả thí nghiệ m khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Enrofloxacin

Dãy nồng độ Giá trị 1 2 3 4 5 0,05 mg/L – 1 mg/L C 0,052 0,104 0,260 0,520 1,039 Abs 0,011 0,012 0,022 0,050 0,110 Hàm số y = 0,1027x + 0,0004 (R = 0,9944) 1 mg/L – 5 mg/L C 1,039 2,078 3,117 4,156 5,195 Abs 0,106 0,217 0,322 0,432 0,535 Hàm số y = 0,1033x + 0,0005 (R = 0,9999) 5 mg/L – 25 mg/L C 5,195 10,390 15,585 20,780 25,975 Abs 0,541 1,074 1,606 2,138 2,477 Hàm số y = 0,095x + 0,0868 (R = 0,9968)

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:31

Bảng 3-5: Kế t quả thí nghiệ m khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Marbofloxacin

Dãy nồng độ Giá trị 1 2 3 4 5 0,05 mg/L – 1 mg/L C 0,056 0,113 0,282 0,564 1,128 Abs 0,006 0,008 0,019 0,047 0,104 Hàm số y = 0,0933x - 0,0032 (R = 0,9968) 1 mg/L – 5 mg/L C 1,128 2,256 3,384 4,512 5,640 Abs 0,102 0,183 0,265 0,347 0,428 Hàm số y = 0,0724x + 0,021 (R = 1,000) 5 mg/L – 25 mg/L C 5,640 11,280 16,920 22,560 28,200 Abs 0,430 0,848 1,272 1,679 2,065 Hàm số _{y = 0,0727x + 0,0285 (R = 0,9998)}

Bảng 3-6: Kết quả thí nghiệ m khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Norfloxacin

Dãy nồng độ Giá trị 1 2 3 4 5 0,05 mg/L – 1 mg/L C 0,056 0,112 0,279 0,559 1,117 Abs 0,012 0,014 0,031 0,064 0,130 Hàm số y = 0,1134x + 0,0021 (R = 0,9987) 1 mg/L – 5 mg/L C 1,117 2,234 3,351 4,468 5,585 Abs 0,139 0,255 0,370 0,485 0,600 Hàm số y = 0,1032x + 0,024 (R = 0,9999) 5 mg/L – 25 mg/L C 5,585 11,170 16,755 22,34 27,925 Abs 0,605 1,199 1,771 2,340 2,743 Hàm số y = 0,097x + 0,1065 (R = 0,9977)

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:32

Hình 3-6: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ ER từ 0,05 mg/L – 1 mg/L

Hình 3-7: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ NL từ 5 mg/L – 25 mg/L

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:33

Hình 3-9: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 5 mg/L – 25 mg/L

Hình 3-10: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 0,05 mg/L – 1 mg/L

c) Nhận xét:

 Đối với Enrofloxacin:

+ Ở khoảng nồng độ từ 0,25 mg/L – 20 mg/L thì Abs tuyến tính với nồng độ. + Ở khoảng nồng độ trên 20 mg/L, giá trị Abs thực tế nhỏ hơn giá trị Abs lý thuyết. + Ở khoảng nồng độ nhỏ hơn 0,25 mg/L, giá trị Abs thực tế lớn hơn giá trị Abs lý thuyết.

 Đối với Norfloxacin:

+ Ở khoảng nồng độ từ 0,5 mg/L – 20 mg/L thì Abs tuyến tính với nồng độ. + Ở khoảng nồng độ trên 20 mg/L, giá trị Abs thực tế nhỏ hơn giá trị Abs lý thuyết. Ở khoảng nồng độ nhỏ hơn 0,5 mg/L, giá trị Abs thực tế lớn hơn giá trị Abs lý thuyết.

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:34

 Đối với Marbofloxacin:

+ Ở khoảng nồng độ từ 0,25 mg/L – 25 mg/L thì Abs tuyến tính với nồng độ. + Ở khoảng nồng độ trên 25 mg/L, giá trị Abs thực tế nhỏ hơn giá trị Abs lý thuyết. + Ở khoảng nồng độ nhỏ hơn 0,25 mg/L, giá trị Abs thực tế lớn hơn giá trị Abs lý thuyết.

3.2

3.2.1Độ chọn lọc

Thí nghiệm 4: Đánh giá độ chọn lọc của kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương

pháp quang phổ

a) Thực hiện:

Thực hiện thí nghiệm trên mẫu Enrofloxacin. – Tạo dung dịch đơn thành phần:

+ Dung dịch ER (DD1): Lấy 100,1 mg ER cho vào BĐM 100 mL, thêm dung dịch NaOH 0,1 M đến vạch được dung dịch chuẩn ER. Pha lỗng dung dịch chuẩn theo tỉ lệ 1/250, nồng độ ER trong dung dịch theo lý thuyết là 4,004 mg/L. + Dung dịch Norfloxacin (DD2): Lấy 100,4 mg Norfloxacin cho vào BĐM 100 mL, thêm dung dịch NaOH 0,1 M đến vạch được dung dịch chuẩn Norfloxacin. Pha lỗng dung dịch chuẩn theo tỉ lệ 1/250, nồng độ Norfloxacin trong dung dịch theo lý thuyết là 4,016 mg/L.

– Tạo dung dịch đa thành phần (DD3): Lấy 1 mL dung dịch chuẩn ER và Norfloxacin cho vào BĐM 250 mL, thêm dung dịch NaOH 0,1 M đến vạch.

– Đo trên máy quang phổ: điều kiện đo phổ tương tự thí nghiệm 3.

b) Kết quả:

+ Bảng kết quả:

Bảng 3-7: Kết quả thí nghiệm đánh giá độ chọn lọc

Chất Mẫu DD1 DD2 DD3

Enrofloxacin ^{C (mg/L) 4,004 0 4,016}

SVTH: Nguyễn Văn Khi & Lê Minh Vấn Trang:35

+ Phổ đồ:

Hình 3-11: Đánh giá độ chọn lọc của phương pháp quang phổ đối với ER

c) Nhận xét:

 Tại bước sĩng max = 271 nm của Enrofloxacin, Norfloxacin cĩ hấp thu dẫn đến làm tăng Abs của dung dịch hỗn hợp.

 Kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ cĩ tính chọn lọc khơng cao đối với các chất khảo sát khi chứa các thành phần gây nhiễu.

3.2.2Độ lặp lại

Thí nghiệm 5: Đánh giá độ lặp lại của kỹ thuật thêm chuẩn trên phương pháp quang

phổ

a) Thực hiện:

Thực hiện thí nghiệm đối với cả 3 chất: Enrofloxacin, Norfloxacin, Marbofloxacin.  Đánh giá độ lập lại đối với Enrofloxacin: