Dựa trên kết quả nghiên cứu độ ổn định thuốc tiêm pentoxifylin, xử lý số liệu để tính tuổi thọ thuốc tiêm.
Bảng 3.22 Phương trình hồi qui tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng pentoxifylin còn lại và thời gian bảo quản (t) của mẫu
Nhiệt độ Bậc phản ứng Phƣơng trình hồi quy tuyến tính R2
Nhiệt độ thực Bậc 0 C0-Ct = 0,108 t -0,548 0,726 Bậc 1 Ln(C0/Ct) = 0,0004 t – 0,0055 0,726 Bậc 2 1/Ct – 1/C0 = 1,1 *10^-5 t – 5,5 *10^-5 0,725 40 oC ± 2 0C Bậc 0 C0-Ct = 0,115 t + 0,214 0,528 Bậc 1 Ln(C0/Ct) = 0,0012 t – 0,0021 0,527 Bậc 2 1/Ct – 1/C0 = 1,2 *10^-5 t + 2,1 *10^-5 0,526
63 50 oC ± 2 0C Bậc 0 C0-Ct = 0,091 t – 0,355 0,283 Bậc 1 Ln(C0/Ct) = 0,00091 t – 0,00355 0,284 Bậc 2 1/Ct – 1/C0 = 9,11 *10^-6 t + 0,00996 0,285
Nhận xét: Ở nhiệt độ 40 ± 2 0C, phương trình mô tả động học phản ứng có bình phương hệ số tương quan R2
= 0,526. Nhưng ở nhiệt độ 50 ± 2 0C giá trị bình phương hệ số tương quan R2 = 0,284 không có giá trị thống kê. Điều này chứng tỏ càng tăng nhiệt độ thì động học phân hủy của thuốc càng thay đổi. Do đó, không thể dùng mô hình động học để mô tả phản ứng phân hủy của pentoxifylin trong thuốc tiêm pentoxifylin, không nên dùng phương pháp dự đoán tuổi thọ của thuốc tiêm pentoxifylin bằng phương pháp sử dụng phương trình Arrhenius.
Tiếp tục dự đoán tuổi thọ thuốc tiêm pentoxifylin ở điều kiện thực bằng phần mềm MINITAB 17. Kết quả được thể hiện trong hình 3.16 và 3.17
Hình 3.16: Đồ thị dự đoán tuổi thọ thuốc tiêm PTX theo nồng độ PTX ở điều kiện thực
Nhận xét: Ở điều kiện thưc, nồng độ PTX trong thuốc tiêm có xu hướng giảm và tuân theo phương trình “Nồng độ PTX = 100 – 0,00677 x Thời gian. Từ đó
64
tính được tuổi thọ thuốc tiêm PTX theo nồng độ PTX là: T90 = (100-90)/0,00677 = 147,7 Tuần (tương đương 37 tháng).
Hình 3.17: Đồ thị dự đoán tuổi thọ thuốc tiêm PTX theo pH ở điều kiện thực
Nhận xét: pH của thuốc tiêm PTX có xu hướng tăng và dự đoán tuổi thọ thuốc tiêm PTX theo pH là 195,8 tuần (tương đương 49 tháng).
Kết quả thu được là rất khả quan, tuy nhiên chưa thể kết luận được tuổi thọ của thuốc tiêm PTX do mới chỉ dự đoán được tuổi thọ thuốc tiêm PTX theo chỉ tiêu hàm lượng và pH, chưa đầy đủ theo dự thảo tiêu chuẩn cơ sở của thuốc tiêm.
65
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. Về phƣơng pháp định lƣợng
Phương pháp HPLC với các thông số đã khảo sát đạt tính thích hợp của hệ thống, tính chọn lọc và độ lặp lại. Điều này phù hợp với quy định tại ISO 17025 khi áp dụng một phương pháp đã có trong dược điển cần thẩm tra xác định giá trị sử dụng của phương pháp bao gồm tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tính chọn lọc, độ lặp lại trung gian.
Kết quả cho thấy phương pháp HPLC có tính chọn lọc và độ lặp lại trung gian tốt, chứng tỏ phương pháp đã chọn là phù hợp để áp dụng định lượng pentoxifylin trong thuốc tiêm.
Tính chọn lọc của phương pháp cho thấy các pic đều có độ phân giải lớn hơn 1,5 tức là các pic tách nhau hoàn toàn, đảm bảo việc sử dụng chuẩn nội trong phương pháp định lượng không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất phân hủy. So sánh với phương pháp định lượng trong nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC với cột Zorbax (Eclipse XDB- C18 Rapid Resolution HT 4,6 mm x 50 mm, 1,8 µm), áp suất chịu được lớn nhất của cột này là 600 bar trên hệ máy Agilent RRLC – MS có độ phân giải của pic pentoxifylin và tạp phân hủy hydrogen peroxyd là 3,29 đến 3,32 thì độ phân giải của hệ thống sử dụng trong luận văn là 3,38 như vậy độ phân giải tương đương với nghiên cứu trên. RSD của pic pentoxifylin đạt được trong nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự là 0,07 [18] còn của luận văn đạt được là 0,21; RSD của độ lặp lại trung gian trong nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự là 0,35 % còn của luận văn đạt được là 0,6 %. Thời gian phân tích trong nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự là 3,5 phút trong khi của luận văn là 7 đến 10 phút. Như vậy tuy thời gian phân tích trong luận văn dài hơn do điều kiện sắc ký không bằng nhưng vẫn đảm bảo tính thích hợp của hệ thống, độ phân giải và độ lặp lại trung gian tương đương so với phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng trong nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự.
Phương pháp sử dụng chuẩn nội là cafein là chất rất ổn định, đảm bảo cho việc loại trừ sai số hệ thống. Điều này là phù hợp với chuyên luận sử dụng trong
66
dược điển Mỹ, tuy nhiên không giống như trong các nghiên cứu về phương pháp định lượng pentoxifylin của các bài báo nghiên cứu. Việc các bài báo nghiên cứu không sử dụng chuẩn nội cafein là do trong các nghiên cứu đó không cần kết quả chính xác hàm lượng của pentoxifylin mà chỉ là các nghiên cứu khảo sát độ ổn định của pentoxifylin trong các điều kiện khác nhau. Chất chuẩn nội cafein trong thời gian phân tích ngắn không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện lão hóa cưỡng bức.
Chất chuẩn sử dụng trong luận văn dùng 2 chuẩn gồm chuẩn pentoxifylin và chuẩn cafein, không sử dụng tạp chuẩn nhưng đã chứng minh được các loại tạp trong công thức không ảnh hưởng đến pic của pentoxifylin và cafein (phần độ đặc hiệu).
So sánh với nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự, phương pháp định lượng tách được 1 tạp phân hủy với hydrogen peroxyd và 2 tạp phân hủy với natri hydroxyd, giống với luận văn tách được 1 tạp phân hủy với hydrogen peroxyd tuy nhiên khác luận văn ở chỗ luận văn chỉ tách được 1 tạp phân hủy với natri hydroxyd. Điều này có thể do trong nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC với cột Zorbax (Eclipse XDB- C18 Rapid Resolution HT 4,6 mm x 50 mm, 1,8µm), áp suất chịu được lớn nhất của cột này là 600 bar trên hệ máy Agilent RRLC – MS nên phân tách được các chất tốt hơn cột thông thường.
4.2. Về xây dựng công thức bào chế thuốc tiêm pentoxifylin
Đây là đề tài đầu tiên về xây dựng công thức thuốc tiêm pentoxifylin được công bố. Công thức bào chế được xây dựng trong đề tài nghiên cứu dựa trên cơ sở khảo sát các yếu tố bao gồm pH, loại đệm, chất chống oxy hóa, nhiệt độ, ánh sáng. Kết quả thu được như sau:
- Phương pháp đánh giá: Có sự khác nhau rất lớn giữa luận văn và các
đề tài khác do pentoxifylin là một chất khá ổn định, ở các điều kiện thông thường hoặc các điều kiện tủ vi khí hậu 40 ± 2 0C, tủ sấy 50 ± 2 0C, đun sôi liên tục 8 tiếng đồng hồ hay hấp tiệt khuẩn trong thời gian lâu ít làm ảnh hưởng đến hàm lượng pentoxifylin. Vì vậy, để đánh giá lựa chọn công thức thuốc tiêm pentoxifylin tối ưu, phương pháp được lựa chọn để đánh giá là điều kiện lão hóa cưỡng bức – đó là điều
67
kiện rất khắc nghiệt tác động lên hoạt chất để hoạt chất sớm bộc lộ ra đặc tính ổn định.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và hệ đệm đến độ ổn định của
pentoxifylin: Nghiên cứu đã chỉ ra được ảnh hưởng của pH và loại đệm đến độ ổn định của phản ứng thủy phân pentoxifylin và phản ứng oxy hóa pentoxifylin bởi hydrogen peroxyd. Kết quả là pentoxifylin ổn định ở pH acid và trung tính, bắt đầu bị thủy phân mạnh từ pH 10. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu đã công bố về độ ổn định của pentoxifylin. Tuy nhiên các nghiên cứu đã công bố về độ ổn định của pentoxifylin mới chỉ nghiên cứu được sự phân hủy của pentoxifylin trong môi trường acid hydrocloric 0,1 N và natri hydroxyd 0,1N mà chưa nghiên cứu được trên toàn dải pH và chưa đưa ra được từ pH nào pentoxifylin bị phân hủy. Các thí nghiệm trong luận văn đã nghiên cứu được độ ổn định của pentoxifylin theo toàn dải pH và kết quả cho thấy phù hợp với các nghiên cứu đã công bố và phù hợp với công thức cấu tạo của pentoxifylin. Công thức cấu tạo của pentoxifylin có bốn Nitơ trong đó có 2 nhóm amid có cặp điện tử p của nguyên tử Nitơ liên hợp với cặp điện tử π của nhóm carbonyl nên pentoxifylin không tham gia phản ứng đặc trưng của ceton và có tính base rất yếu. Trong môi trường acid tạo muối kiềm, trong nước pentoxifylin bị thủy phân chậm khi có mặt xúc tác base tạo acid. Vì vậy trong môi trường pH từ 10 trở lên pentoxifylin bị thủy phân và có thể cắt theo 2 gốc amid tạo thành 2 tạp chất phân hủy natri hydroxyd. Tuy nhiên luận văn chưa tách được 2 chất này mà chỉ xuất hiện 1 pic chung. So sánh với kết quả phổ MS mẫu thủy phân với natri hydroxyd thì trên phổ MS có xuất hiện chất có khối lượng phân tử 253 và 297 vì vậy có thể định tính rằng trong mẫu có hai chất phân hủy giống với nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự đã công bố [18]. Phổ MS của mẫu thủy phân với natri hydroxyd được đính kèm trong luận văn phần phụ lục 5. Về việc lựa chọn pH và loại đệm trong công thức tối ưu: dựa vào việc nghiên cứu một số mẫu chế phẩm trên thị trường cho thấy kết quả pH tối ưu và loại đệm sử dụng là giống với một số chế phẩm trên thị trường : pH tối ưu là 6,45 còn mẫu trên thị trường như BICAPROL đo được là 6,46; loại đệm một số trang web cung cấp là loại đệm
68
phosphat cũng phù hợp với nghiên cứu cho công thức tối ưu là sử dụng hệ đệm phosphat.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất chống oxy hóa đến độ ổn định của pentoxifylin: luận văn đã nghiên cứu và tách được 1 tạp chất oxy hóa của pentoxifylin với hydrogen peroxyd 30%. Điều này phù hợp với các nghiên cứu đã công bố. Về cơ chế phản ứng, nhiều tác giả cho rằng đây là phản ứng tạo hợp chất dihydrogen peroxyd xảy ra khi hợp chất ceton phản ứng với dung dịch hydrogen peroxyd, là phản ứng đã được biết đến tạo acryclic peroxyd có tính chất chống sốt rét [35]. So sánh với kết quả đo phổ MS của mẫu phân hủy với hydrogen peroxyd nhận thấy có xuất hiện chất có khối lượng phân tử 329. Vì vậy có thể định tính sơ bộ là chất phân hủy trong thuốc tiêm pentoxifylin khi kết hợp với hydrogen peroxyd là giống với tạp chất đã nêu trong nghiên cứu của Mahesh Kumar và cộng sự. Dữ liệu phổ MS của mẫu phân hủy với hydrogen peroxyd được đính kèm trong luận văn phần phụ lục. Về lựa chọn chất chống oxy hóa: nghiên cứu này chỉ ra được tuy pentoxifylin khá ổn định nhưng pH lại rất dễ thay đổi trong quá trình bảo quản. Nghiên cứu này cho thấy lựa chọn EDTA là chất chống oxy hóa vừa giúp chế phẩm ổn định pH lại vừa làm tăng độ ổn định về hàm lượng pentoxifylin hơn nhiều các chất chống oxy hóa khác. Nồng độ EDTA cũng được sử dụng làm biến đầu vào để lựa chọn công thức tối ưu.
Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong xây dựng công thức thuốc tiêm pentoxifylin, lựa chọn được 4 biến đầu vào để tiến hành thiết kế thí nghiệm dùng phần mềm MODDE 8.0: thiết kế thí nghiệm với 4 biến đầu vào và 2 biến đầu ra, lựa chọn sàng lọc, thiết kế hợp tử tại tâm gồm 22 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm ở tâm. Tiến hành pha mẫu, định lượng hàm lượng pentoxifylin còn lại và đo sự chênh lệch pH thu được kết quả thực nghiệm. Các kết quả này được xử lý bằng phần mềm InForm v 3.1 và FormRules v2.0 thu được bảng các giá trị tối ưu cho biến đầu vào trong công thức thuốc tiêm pentoxifylin. Tiến hành đánh giá công thức tối ưu so sánh với kết quả dự đoán của phần mềm InForm v 3.1 ta được kết quả như sau: phần mềm InForm v 3.1 dự đoán hàm lượng pentoxifylin còn lại sau khi lão hóa cưỡng bức với hydrogen peroxyd là 96,62 và chênh pH là 0,03. Thực tế pha mẫu và
69
tiến hành lão hóa cưỡng bức với hydrogen peroxyd cho kết quả hàm lượng pentoxifylin còn lại là 97, 77 % và chênh pH đo được là 0,03. Như vậy, mô hình đã xây dựng mô tả khá chính xác được ảnh hưởng của các yếu tố pH, loại đệm, natri edetat, nồng độ đệm đến độ ổn định của pentoxifylin.
Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của bao bì và sục khí nitrogen đóng ống đến độ ổn định của thuốc tiêm pentoxifylin và lựa chọn được quy trình pha chế dùng ống không màu và không sục khí nitrogen trong dự thảo quy trình pha chế thuốc tiêm pentoxifylin.
Sau khi xây dựng được quy trình bào chế và pha chế với quy mô nhỏ, nghiên cứu đã tiến hành thử độ vô khuẩn của chế phẩm và kết quả chế phẩm đạt độ vô khuẩn.
4.3. Về dự thảo tiêu chuẩn thành phẩm thuốc tiêm pentoxifylin và theo dõi độ ổn định của thuốc
Sau khi dự thảo quy trình pha chế thuốc tiêm pentoxifylin, nghiên cứu đã tiến hành dự thảo tiêu chuẩn thành phẩm dựa trên cơ sở tiêu chuẩn thuốc tiêm nói chung. Dự thảo quy trình pha chế thuốc tiêm pentoxifylin và tiêu chuẩn cơ sở thuốc tiêm pentoxifylin được trình bày trong phần phụ lục.
Quá trình theo dõi độ ổn định: quá trình pha chế thuốc tiêm với quy mô nhỏ 500 ống 2 ml trong điều kiện pha chế không kiểm soát cấp sạch nhưng có tiệt khuẩn sau khi đóng ống ở 121 0C trong 30 phút nên đảm bảo được độ vô khuẩn tuy nhiên chưa đánh giá được chỉ tiêu chí nhiệt tố.
Nghiên cứu tiến hành theo dõi độ ổn định về hàm lượng Pentoxifylin còn lại và chênh lệch pH được 2 tháng với 3 điều kiện: điều kiện thực, điều kiện lão hóa cấp tốc 40 ± 2 oC và 50 ± 2 oC của thuốc. Dữ liệu cho thấy thuốc tiêm Pentoxifylin ổn định trong vòng 2 tháng ở các điều kiện thực, điều kiện lão hóa cấp tốc và cho thấy chưa có sự thay đổi lớn trong chỉ tiêu chất lượng của thuốc tiêm Pentoxifylin.
70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ kết quả thực nghiệm, nghiên cứu rút ra được một số kết luận như sau:
1. Xây dựng và tối ưu hóa công thức thuốc tiêm pentoxifylin: nghiên cứu đã khảo sát được ảnh hưởng của ánh sáng, nhiệt độ, pH, loại đệm, nồng độ đệm, loại chất chống oxy hóa, nồng độ chất chống oxy hóa, bao bì, sục khí nitrogen đến độ ổn định của công thức thuốc tiêm pentoxifylin. Nghiên cứu đã xây dựng được công thức tối ưu thuốc tiêm pentoxifylin 20 mg/ml.
Thành phần 1 ống thuốc 5 ml chứa:
Pentoxifylin 17,5 mg 100 mg
Dinatri edetat 2.5 mg
Natri hydroxyd 8 mg
Natri dihydrogen phosphate dihydrat 78 mg
Natri chloride 5 mg
Acid hydrocloric Điều chỉnh pH = 6,45
Nước cất pha tiêm vừa đủ Ống thủy tinh không màu 5 ml
2. Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pentoxifylin:
- Đã dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho thành phẩm thuốc tiêm pentoxifylin 20 mg/ml (Phụ lục 1).
- Đã xây dựng quy trình pha chế thuốc tiêm pentoxifylin với quy mô 1 lít dung dịch (tương ứng 500 ống 2 ml) (Phụ lục 2) và theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pentoxifylin đã pha chế trong 2 tháng ở điều kiện thực, điều kiện lão hóa cấp tốc 40 ± 2 oC và 50 ± 2 oC.
71
KIẾN NGHỊ
Do thời gian thực hiện có hạn, những nghiên cứu và đánh giá của luận văn vẫn cần tiếp tục theo dõi để hoàn thiện. Với mong muốn đưa nghiên cứu vào thực tiễn, chúng tôi xin kiến nghị một số vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:
1. Đánh giá các chỉ tiêu khác của thuốc tiêm pentoxifylin như chí nhiệt tố. 2. Tiếp tục theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pentoxifylin được pha theo quy