49
Bảng 3.11 Bảng ký hiệu và mức cần đạt được của các biến đầu ra
STT Biến Ký hiệu Đơn vị Mục tiêu
1 Hàm lượng pentoxifylin còn
lại
Y1 % Max
2 ΔpH Y2 Min
3.3.1.2. Lựa chọn biến đầu vào
Từ các đánh giá sơ bộ ở trên, các biến đầu vào được lựa chọn trong bảng 3.12.
Bảng 3.12 Bảng ký hiệu và yêu cầu của các biến đầu vào
STT Biến Ký hiệu Đơn vị Loại biến Giới hạn
1 pH X1 Định lượng 6 đến 7
2 Dinatri edetat X2 % Định lượng 0,01 đến 0,05
3 Loại đệm X3 Định tính Phosphat hoặc
Citrat
4 Nồng độ đệm X4 mM Định lượng 10 đến 100
3.3.1.3. Thiết kế thí nghiệm
Thiết kế mặt hợp tử tại tâm nhờ phần mềm MODDE 8.0 thu được bảng thiết kế thí nghiệm gồm 22 thí nghiệm trong đó gồm 3 thí nghiệm trung tâm như sau:
Bảng 3.13 Bảng thiết kế thí nghiệm
STT Tên mẫu Thứ tự pH EDTA Loại đệm Nồng độ đệm
1 N1 13 6,00 0,01 Phosphat 10 2 N2 2 7,00 0,01 Phosphat 10 3 N3 10 6,00 0,05 Phosphat 10 4 N4 3 7,00 0,05 Phosphat 10 5 N5 1 6,00 0,01 Citrat 10 6 N6 12 7,00 0,01 Citrat 10 7 N7 8 6,00 0,05 Citrat 10
50 8 N8 18 7,00 0,05 Citrat 10 9 N9 5 6,00 0,01 Phosphat 100 10 N10 16 7,00 0,01 Phosphat 100 11 N11 19 6,00 0,05 Phosphat 100 12 N12 6 7,00 0,05 Phosphat 100 13 N13 15 6,00 0,01 Citrat 100 14 N14 14 7,00 0,01 Citrat 100 15 N15 11 6,00 0,05 Citrat 100 16 N16 17 7,00 0,05 Citrat 100 17 N17 7 6,50 0,03 Phosphat 55 18 N18 4 6,50 0,03 Phosphat 55 19 N19 9 6,50 0,03 Phosphat 55 20 N20 6,30 0,02 Phosphat 10 21 N21 6,00 0,02 Phosphat 20 22 N22 6,70 0,02 Citrat 20 3.3.2 Tiến hành thí nghiệm
Pha các mẫu thuốc tiêm theo công thức và thứ tự trong bảng thiết kế thí nghiệm trên. Mỗi mẫu pha 100 ml, đo áp suất thẩm thấu để điều chỉnh đẳng trương bằng natri clorid, đóng ống thủy tinh không màu 2 ml bằng máy đóng ống tiêm ROTA. Các mẫu sau khi đóng xong được đem đi tiệt khuẩn ở 121 0C trong 30 phút.
Đo sự thay đổi hàm lượng của các mẫu sau khi lão hóa cưỡng bức với hydrogen peroxyd 30 % và đo sự thay đổi pH sau 2 tháng ở điều kiện thường ta thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.14.
Bảng 3.14 Bảng kết quả thí nghiệm
STT Tên
mẫu Thứ tự pH EDTA Loại đệm
C đệm ΔpH %Pentoxifylin còn lại 1 N1 13 6,00 0,01 Phosphat 10 0,02 28,17 2 N2 2 7,00 0,01 Phosphat 10 0,01 49,17
51 3 N3 10 6,00 0,05 Phosphat 10 0,03 31,62 4 N4 3 7,00 0,05 Phosphat 10 0,02 53,50 5 N5 1 6,00 0,01 Citrat 10 0,09 86,12 6 N6 12 7,00 0,01 Citrat 10 0,06 90,40 7 N7 8 6,00 0,05 Citrat 10 0,04 87,66 8 N8 18 7,00 0,05 Citrat 10 0,02 90,30 9 N9 5 6,00 0,01 Phosphat 100 0,02 91,34 10 N10 16 7,00 0,01 Phosphat 100 0,09 98,68 11 N11 19 6,00 0,05 Phosphat 100 0,05 90,77 12 N12 6 7,00 0,05 Phosphat 100 0,01 95,84 13 N13 15 6,00 0,01 Citrat 100 0,07 96,30 14 N14 14 7,00 0,01 Citrat 100 0,03 96,95 15 N15 11 6,00 0,05 Citrat 100 0,05 94,74 16 N16 17 7,00 0,05 Citrat 100 0,08 99,61 17 N17 7 6,50 0,03 Phosphat 55 0,02 92,32 18 N18 4 6,50 0,03 Phosphat 55 0,00 91,07 19 N19 9 6,50 0,03 Phosphat 55 0,01 94,23 20 N20 6,30 0,02 Phosphat 10 0,05 28,98 21 N21 6,00 0,02 Phosphat 20 0,01 30,90 22 N22 6,70 0,02 Citrat 20 0,02 94,81
3.3.3 Phân tích ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra
Dùng phần mềm INForm v3.1 để xử lý số liệu của các biến đầu vào và biến đầu ra thu được kết quả trong bảng 3.15:
Bảng 3.15 Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo
Biến phụ thuộc Số đơn vị đầu vào Số đơn vị đầu ra Số đơn vị ẩn Số lần luyện R2 luyện (%) Y1 4 1 1 10000 83,7359 Y2 4 1 1 10000 99,8104
52
Nhận xét: kết quả xử lý cho thấy R2 luyện của các biến đều lớn hơn 80 % chứng tỏ quan hệ giữa biến độc lập và biến phụ thuộc được mô tả chính xác bằng mạng neuron nhân tạo. Phân tích ảnh hưởng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc bằng phần mềm FormRules v2.0 cho kết quả thể hiện trong bảng 3.16.
Bảng 3.16 Ảnh hưởng của các biến độc lập đến biến phụ thuộc
Biến phụ thuộc Biến độc lập Y1 Y2 X1 - + X2 - - X3 + + X4 - +
Ghi chú “+”: có ảnh hưởng; “-” : không ảnh hưởng
Mặt đáp hình 3.5 đến 3.15 thể hiện rõ hơn ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra:
Hình 3.5 Mặt đáp của hàm lượng pentoxifylin còn lại theo thang pH và loại đệm khi EDTA là 0,03 % và nồng độ đệm là 55 mM
Nhận xét: Khi EDTA là 0,03 % và nồng độ đệm là 55 mM thì với hệ đệm phosphat, ở pH từ 6,45 đến 6,7 cho hàm lượng pentoxifylin cao nhất, giảm dần về 2 phía.
53
Với hệ đệm citrat thì ngược lại, pH từ 6,45 đến 6,7 cho hàm lượng pentoxifylin thấp nhất và tăng dần về 2 phía.
Điều này không mâu thuẫn với các kết quả đã được thể hiện ở phần 3.2.1.2. Ở phần 3.2.1.2, các khảo sát mới chỉ thực hiện sơ bộ nghiên cứu tại điểm pH 6 và pH 7, chưa tiến hành khảo sát ở pH 6,5. Mặt đáp hình 3.5 cho thấy rõ ràng tại pH 6 và pH 7 hàm lượng pentoxifylin còn lại khi dùng hệ đệm citrat cao hơn so với hệ đệm phosphat, điều này là giống như kết quả đã đưa ra ở phần 3.2.1.2.
Trong khoảng pH 6 đến pH 7, sự tương tác giữa các thành phần phức tạp hơn. Các nghiên cứu ở phần 3.2.1.2. chưa sử dụng EDTA trong khi ở các nghiên cứu trong phần này đã sử dụng EDTA làm chất chống oxy hóa cho chế phẩm. Vì vậy việc lý giải hệ đệm citrat giúp khóa ion kim loại làm giảm phản ứng oxy hóa dược chất không còn đúng nữa bởi hệ đệm phosphat cũng có tác dụng chống oxy hóa nhờ khả năng khóa ion kim loại của EDTA.
Hình 3.6 Mặt đáp của hàm lượng pentoxifylin còn lại theo nồng độ đệm và bậc thang pH khi EDTA là 0,03 % và hệ đệm phosphat
Nhận xét: Khi sử dụng hệ đệm phosphat và EDTA là 0,03 % thì hàm lượng pentoxifylin càng cao khi nồng độ đệm càng cao và càng ở trong khoảng pH 6,4 đến 6,7.
54
Hình 3.7 Mặt đáp của hàm lượng pentoxifylin còn lại theo nồng độ đệm và loại đệm khi EDTA là 0,03 % và pH là 6,5
Nhận xét: Khi EDTA là 0,03 % và pH là 6,5 thì đối với cả hai hệ đệm citrat và phosphat, nồng độ đệm tăng làm tăng hàm lượng pentoxifylin còn lại và hệ đệm phosphat cho hàm lượng pentoxifylin còn lại cao hơn nhiều so với hệ đệm citrat. Điều này có vẻ ngược với các kết quả ở phần 3.2.1.2 nhưng từ những kết quả ở mặt đáp hình 3.5 cho thấy điều này hoàn toàn hợp lý với các kết quả đã đạt được. Mặt đáp hình 3.7 là ở pH 6,5, tại pH này mặt đáp hình 3.5 chỉ rõ tại pH từ 6,45 đến 6,7 hàm lượng pentoxifylin cao nhất với hệ đệm phosphat và thấp nhất với hệ đệm citrat. Điều này cũng có thể được giải thích nhờ vào việc sử dụng EDTA khóa ion kim loại làm chất chống oxy hóa cho chế phẩm giúp cho hệ đệm phosphat cũng có khả năng chống oxy hóa như hệ đệm citrat.
55
Hình 3.8 Mặt đáp của hàm lượng pentoxifylin còn lại theo nồng độ EDTA và pH khi sử dụng đệm phosphat và nồng độ đệm là 55 mM
Nhận xét: Khi sử dụng đệm phosphat và nồng độ đệm là 55 mM, hàm lượng pentoxifylin chỉ bị ảnh hưởng bởi pH và không phụ thuộc vào nồng độ EDTA. pH từ 6,45 đến 6,7 cho hàm lượng pentoxifylin cao nhất và giảm dần khi pH tăng đến 7 hoặc giảm về 6.
Hình 3.9 Mặt đáp của hàm lượng pentoxifylin còn lại theo nồng độ EDTA và loại đệm khi pH là 6,5 và nồng độ đệm là 55 mM
Nhận xét: Ở pH 6,5 và nồng độ đệm 55 mM, hàm lượng pentoxifylin ảnh hưởng bởi loại đệm, không bị ảnh hưởng bởi nồng độ EDTA. Hệ đệm phosphat cho hàm lượng pentoxifylin cao hơn nhiều so với hệ đệm citrat.
56
Hình 3.10 Mặt đáp của sự chênh lệch pH theo EDTA và bậc thang pH khi sử dụng hệ đệm phosphat và nồng độ đệm là 55 mM
Nhận xét: Khi sử dụng hệ đệm phosphat và nồng độ đệm là 55 mM thì sự chênh lệch pH không bị ảnh hưởng bởi EDTA và giá trị pH.
Hình 3.11 Mặt đáp của sự chênh lệch pH theo nồng độ đệm và pH khi EDTA là 0,03% và sử dụng hệ đệm phosphat
Nhận xét: Khi sử dụng hệ đệm phosphat và EDTA là 0,03 % thì sự chênh lệch pH không bị ảnh hưởng bởi nồng độ đệm và giá trị pH.
57
Hình 3.12 Mặt đáp của sự chênh lệch pH theo loại đệm và bậc thang pH khi EDTA là 0,03 % và nồng độ đệm là 55 mM
Nhận xét: Sự chênh lệch pH bị ảnh hưởng bởi loại đệm và không bị ảnh hưởng bởi pH. Đệm phosphat cho chênh lệch pH thấp còn đệm citrat cho chênh lệch pH cao.
Hình 3.13 Mặt đáp của sự chênh lệch pH theo loại đệm và nồng độ EDTA khi pH là 6,5 và nồng độ đệm là 55 mM
Nhận xét: Ở pH 6,5 và nồng độ đệm 55 mM, sự chênh lệch pH không bị ảnh hưởng bởi EDTA mà chỉ bị ảnh hưởng bởi loại đệm. Đệm phosphat cho sự chênh lệch pH thấp, đệm citrat cho sự chênh lệch pH cao.
58
Hình 3.14 Mặt đáp của sự chênh lệch pH theo nồng độ đệm và nồng độ EDTA khi pH là 6,5 và sử dụng hệ đệm phosphat
Nhận xét: Ở pH 6,45 và sử dụng hệ đệm phosphat, sự chênh lệch pH là thấp và không bị ảnh hưởng bởi nồng độ đệm và nồng độ EDTA.
Hình 3.15 Mặt đáp của sự chênh lệch pH theo nồng độ đệm và loại đệm khi EDTA là 0,03% và pH là 6,5
Nhận xét: Ở pH 6,5 và nồng độ EDTA là 0,03 % thì sự chênh lệch pH chỉ phụ thuộc vào loại đệm mà không phụ thuộc vào nồng độ đệm. Đệm phosphat cho chênh lệch pH thấp, còn đệm citrat cho chênh lệch pH cao.
3.3.4 Lựa chọn công thức tối ưu
59
Từ kết quả 22 thí nghiệm sử dụng phương pháp tối ưu hóa bằng phần mềm INForm v3.1 tối ưu được các biến đầu vào như sau:
Bảng 3.17 Giá trị tối ưu cho các biến đầu vào trong xây dựng công thức thuốc tiêm pentoxifylin
STT Biến đầu vào Giá trị tối ƣu
1 pH 6,45
2 EDTA (%) 0,05
3 Loại đệm Phosphat
4 Nồng độ đệm (mM) 100
Kết quả dự đoán: hàm lượng PTX còn lại sau khi lão hóa cưỡng bức với hydrogen peroxyd là 96,62 %; chênh pH là 0,03
Như vậy, công thức thuốc tiêm pentoxifylin được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu có thành phần như sau:
Bảng 3.18 Công thức tối ưu thuốc tiêm pentoxifylin
STT Thành phần % (khối lƣợng/thể tích) % (khối lƣợng/thể tích) 1 Pentoxifylin 2,00 2,00 2 EDTA 0,05 0,05 3 Natri dihydrogen phosphat dihydrat 1,56 1,56
4 Natri hydroxyd Vừa đủ pH = 6,45 0,16
5 Natri clorid Vừa đủ đẳng trương 0,1
6 Acid hydrocloric 1 N Vừa đủ pH = 6,45 Vừa đủ pH = 6,45
60
Tiến hành pha mẫu tối ưu và lão hóa cưỡng bức với hydrogen peroxyd như thực hiện với bảng thiết kế thí nghiệm cho kết quả hàm lượng pentoxifylin còn lại là 97,77 % và chênh pH đo được là 0,03 không sai khác nhiều so với kết quả dự đoán.
3.4 Ảnh hƣởng của các yếu tố khác đến độ ổn định của thuốc tiêm Pentoxifylin Pentoxifylin
3.4.1. Ảnh hưởng của bao bì
Như phân tích trong phần tổng quan, trong các yếu tố về công thức có ảnh hưởng tới độ ổn định của thuốc tiêm, bên cạnh yếu tố về bản chất dược chất, tá dược, dung môi, pH còn một yếu tố ảnh hưởng lớn là bao bì ống chứa thuốc tiêm. Để đánh giá ảnh hưởng của bao bì đến chất lượng thuốc tiêm pentoxifylin, tiến hành pha thuốc tiêm theo công thức tối ưu. Mỗi mẫu pha 100 ml, đóng ống thủy tinh màu hổ phách và không màu. Mẫu đã đóng để trong tủ vi khí hậu ở 40 ± 2 0C trong 1 tháng. Quan sát hình thức về màu sắc, độ trong, định lượng hàm lượng pentoxifylin còn lại, đo pH. Kết quả được trình bày trong bảng:
Bảng 3.19 Ảnh hưởng của bao bì (100 ml, n = 1)
Mẫu Bao bì Tủ vi khí hậu 40 ± 2
0C / 1 tháng Δ pH Hàm lƣợng (%)
17.1 Ống thủy tinh màu hổ phách -0,01 99,68
17.2 Ống thủy tinh không màu -0,02 99,73
Nhận xét:
Giá trị pH không thay đổi nhiều giữa 2 mẫu 17.1 và 17.2 chứng tỏ bao bì không ảnh hưởng đến sự thay đổi pH của thuốc tiêm pentoxifylin.
Hàm lượng pentoxifylin còn lại không khác nhau rõ rệt giữa mẫu 17.1 và 17.2 chứng tỏ bao bì không ảnh hưởng đến hàm lượng thuốc tiêm.
Kết luận: lựa chọn bao bì thủy tinh trong không màu làm bao bì cho thuốc tiêm pentoxifylin.
3.4.2. Ảnh hưởng của sục khí nitrogen
Pha mẫu theo công thức tối ưu, mỗi mẫu 100 ml đong sống thủy tinh 2 ml không màu. Mẫu 18.1 không sục nitrogen, mẫu 18.2 có sục nitrogen. Hai mẫu sau khi đóng ống tiệt khuẩn ở 121 0C trong 30 phút, sau đó để tủ vi khí hậu ở 40 ± 2 0C
61
trong 1 tháng, sau 1 tháng đo sự thay đổi pH và hàm lượng pentoxifylin còn lại, lượng pentoxifylin còn lại khi lão hóa cưỡng bức với hydrogen peroxyd 30 %.
Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.20.
Bảng 3.20 Ảnh hưởng của sục khí nitrogen ( 100 ml, n = 1)
Mẫu Khí nitrogen Tủ vi khí hậu 40 ± 2
0 C / 1 tháng Δ pH Hàm lƣợng còn lại (%) 18.1 Không sục khí -0,02 99,29 18.2 Sục khí -0,03 99,46 Nhận xét:
Giá trị pH không thay đổi nhiều giữa 2 mẫu 18.1 và mẫu 18.2 chứng tỏ việc sục khí nitrogen không làm ảnh hưởng nhiều đến giá trị pH của thuốc tiêm.
Hàm lượng pentoxifylin còn lại giữa 2 mẫu 18.1 và 18.2 cũng không khác nhau nhiều chứng tỏ việc sục khí nitrogen không làm ảnh hưởng đến hàm lượng thuốc tiêm.
Kết luận: lựa chọn không sục khí nitrogen trong quy trình pha chế thuốc tiêm pentoxifylin.
3.5 Theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm theo công thức tối ƣu
Tiến hành pha chế 500 ml thuốc tiêm theo sơ đồ dự thảo quy trình pha chế thuốc tiêm pentoxifylin , đóng ống thủy tinh 2 ml, không màu, tiệt khuẩn 121 0C trong 30 phút.
Theo dõi mẫu trong 3 điều kiện - Nhiệt độ thực
- Tủ vi khí hậu (40 ± 2 0C) - Tủ sấy (50 ± 2 0C)
Tại các thời điểm 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần, lấy mẫu quan sát cảm quan, định lượng hàm lượng pentoxifylin còn lại và pH của dung dịch thuốc tiêm thu được kết quả trong bảng:
62
Bảng 3.21 Kết quả theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pentoxifylin (500 ml, n = 1)
Thời gian (tuần) Nhiệt độ thực 40 oC ± 2 oC 50oC ± 2 oC Hàm lƣợng còn lại (%) ΔpH Hàm lƣợng còn lại (%) ΔpH Hàm lƣợng còn lại (%) ΔpH 1 100,53 -0,02 99,78 -0,03 99,78 0,03 2 100,33 0,03 99,68 -0,04 100,34 -0,09 4 99,84 0,02 98,80 0,02 100,52 -0,10 6 100,14 0,03 99,39 0,04 99,95 0,02 8 99,63 0,04 98,86 0,03 99,28 0,05
Kết quả thử độ vô khuẩn của thuốc tiêm tiến hành đối với mẫu bảo quản nhiệt độ phòng ở các thời điểm 0 tuần và 6 tuần: cả 2 thời điểm đều đạt độ vô khuẩn.
Nhận xét: Sau thời gian bảo quản 8 tuần ở các điều kiện khác nhau, thuốc tiêm Pentoxifylin tối ưu đều ổn định về mặt cảm quan, hàm lượng, pH, độ vô khuẩn.
Tuy nhiên đây mới là kết quả ổn định 8 tuần của thuốc tiêm, cần tiếp tục theo dõi để xác định tuổi thọ của thuốc và hoàn thiện bảng dữ liệu nghiên cứu độ ổn định dài hạn 24 tháng của thuốc tiêm pentoxifylin.
3.6 Dự đoán tuổi thọ thuốc tiêm pentoxifylin
Dựa trên kết quả nghiên cứu độ ổn định thuốc tiêm pentoxifylin, xử lý số liệu