A.3.1. Phƣơng pháp phân tích ẩm độ
Nguyên tắc:
Mẫu đƣợc cân và cho vào trong một cốc sứ (hoặc cốc nhôm) đã biết trọng lƣợng, đặt cốc vào trong tủ sấy ở 105oC đến khi trọng lƣợng ổn định (khoảng 4-5 giờ). Chênh lệch trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy chính là ẩm độ. Dụng cụ và thiết bị: Tủ sấy Cốc nhôm Kẹp Cân phân tích Các bước tiến hành
Sấy cốc ở 105oC trong 2 giờ. Cho cốc vào bình hút ẩm chờ 10 – 20 phút sau cân trọng lƣợng cốc (T).
Cân khoảng 2 – 3 g mẫu cho vào cốc. Ghi trọng lƣợng của mẫu và cốc (W1).
Cho cốc vào bình hút ẩm chờ 10 – 20 phút sau lấy cốc ra cân (W2).
Cách tính:
Trọng lƣợng mẫu ƣớt: mw=W1-T Trọng lƣợng mẫu khô: md=W2-T % Độ ẩm = (mw-md)/mw*100
A.3.2. Phƣơng pháp phân tích protein tổng số (phƣơng pháp Kjeldal)
Nguyên tắc:
Ở nhiệt độ cao, dƣới tác dụng của H2SO4 đậm đặc và có chất xúc tác, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa, carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, còn gốc amin thì bị oxy hóa và giải phóng ra NH3, NH3 tác dụng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đây là giai đoạn công phá đạm trong mẫu.
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
Trong quá trình chƣng cất, (NH4)2SO4 tác dụng với NaOH dƣ và giải phóng ra NH3
(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + H2O
NH3 sinh ra sẽ hấp thụ bằng dung dịch axit boric tạo thành tetraborat amon. Sau đó chuẩn độ dung dịch tetraborat amon bằng dung dịch chuẩn H2SO4, NH3 đƣợc giải phóng và xác định đƣợc lƣợng nitơ, theo các phản ứng sau:
NH3 + H2O NH4OH + H+
2NH4OH + 4H3BO4 (NH4)2B4O7 + 7H2O
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO4 Tính đƣợc % nitơ có trong mẫu nhân với 6,25 sẽ suy ra đƣợc % protein thô. Chỉ số này tùy thuộc vào tỉ lệ của các hợp chất nitơ có trong protein, nói cách khác tùy thuộc vào nguồn gốc của protein (ví dụ: protein trong sữa: 6,38; ngũ cốc: 5,9; gelatin: 5,55; hạt có dầu: 5,4). Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng dùng chỉ số chung là 6,25.
Các bước tiến hành:
Công phá đạm:
Cân 0,2 g mẫu cho vào ống Kjeldal, đặt ống vào trong kệ nhôm.
Cho vào ống lần lƣợt 10 mL H2O2 và 10 mL H2SO4 đậm đặc, để yên 5 phút.
Đặt cả kệ nhôm vào bộ phận công phá đạm. Mở vòi nƣớc và bật máy. Chỉnh nhiệt độ ở 4 mức:
200oC trong 20 phút
300oC trong 20 phút
370oC trong 20 phút
Tắt máy, khoảng 30 phút sau, tắt nƣớc, lấy kệ đỡ ra và chờ nguội hẳn. Nếu dung dịch trong ống nghiệm có màu trắng là quá trình công phá đạm xãy ra hoàn toàn, nếu còn màu vàng thì thêm 5 mL H2O2 và đặt kệ nhôm vào trong bộ phận công phá đạm tiến hành công phá lại nhƣ trên.
Chưng cất:
Kiểm tra NaOH, nƣớc cất trƣớc khi chƣng cất.
Đặt ống nghiệm chứa dung dịch (NH4)2SO4 đã công phá đạm vào đúng vị trí ở hệ thống chƣng cất đạm.
Bên dƣới hệ thống chƣng cất, đặt bình tam giác chứa 10ml axit boric 2%.
Bật máy, đợi khi xuất hiện chữ P thì bấm nút RUN.
Máy chạy khoảng 5 phút, khi xuất hiện chữ “END” thì tắt. Dung dịch trong bình tam giác lúc này có màu xanh.
Chuẩn độ:
Cho từng giọt dung dịch H2SO4 0,1N từ ống buret vào bình tam giác và lắc đều, nhẹ đến khi dung dịch vừa chuyển sang màu hồng nhạt thì dừng lại. Ghi thể tích dung dịch H2SO4 0,1N vừa chuẩn độ.
Cách tính: 100 * % * 0014 , 0 * ) ( % Dr m V V N o
(mẫu khô) (A.4)
Hoặc % ( )*0,0014*100 m V V N o (mẫu ƣớt) (A.5) %CP = %N * 6,25 (A.6) Trong đó: %CP: % protein thô Vo: Thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ mẫu trắng
V: Thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ mẫu đang phân tích
m: Trọng lƣợng mẫu (g)
%Dr: % độ khô (= 100% - độ ẩm%)
0,0014: số g nitơ ứng với 1mL H2SO4 0,1N dùng chuẩn độ
A.3.3. Phƣơng pháp phân tích chất béo thô (phƣơng pháp Soxhlet)
Dung môi chứa trong bình cầu (Chloroform) đƣợc đun nóng bay hơi lên và nhờ hệ thống làm lạnh ngƣng tụ nhỏ giọt xuống thấm qua ống len đựng mẫu và hòa tan các chất béo tự do có trong mẫu. Quá trình này đƣợc lặp lại 15 – 20 lần, tất cả các chất béo đƣợc trich ly ra khỏi mẫu. Sản phẩm thu đƣợc trong bình cầu là dung môi và các chất béo.
Các bước tiến hành:
Cân 0,5 g mẫu cần phân tích cho vào giấy lọc và gói lại, đặt gói mẫu vào tủ sấy ở 105oC đến khi trọng lƣợng không thay đổi (khoảng 4 - 5 giờ đối với mẫu khô, 24 giờ đối với mẫu ƣớt).
Đặt mẫu vào bình hút ẩm và cân nóng (W1). Đong 90 – 100 mL chloroform cho vào bình cầu.
Cho mẫu vào ống len và đặt ống len cùng bình cầu vào đúng vị trí. Mở nƣớc, bật công tắc máy, chỉnh công tắc máy ở vị trí 75%.
Sau 6 – 8 giờ (15 – 20 lần lặp lại) ly trích tắt máy, 30 phút sau tắt nƣớc. Lấy mẫu trong ống len ra và cho vào tủ sấy ở 105oC đến khi trọng lƣợng không thay đổi (khoảng 24 giờ).
Đặt mẫu vào bình hút ẩm và cân nóng (W2).
Cách tính: 100 * % * ) ( % 1 2 Dr W W W Lipid m (mẫu khô) (A.7) Hoặc % ( 1 2)*100 m W W W Lipid (mẫu ƣớt) (A.8) Trong đó: Wm: Khối lƣợng mẫu W1: Khối lƣợng mẫu trƣớc ly trích
W2: Khối lƣợng mẫu sau ly trích
%Dr: % độ khô (= 100% - độ ẩm%)
A.4. Xác định vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm (theo NMKL 86:2006 - Nordic Commoittee Food Analysis- Ủy Ban Phân Tích Thực Phẩm Bắc Nordic Commoittee Food Analysis- Ủy Ban Phân Tích Thực Phẩm Bắc Âu)
Phạm vi áp dụng:
Phƣơng pháp này thích hợp cho việc xác định vi sinh vật hiếu khí có thể phát triển trong thực phẩm và có thể đƣợc áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.
Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật sinh trƣởng ở điều kiện hiếu khí khi phép thử đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp đƣợc mô tả.
Tổng số khuẩn lạc hiếu khí là số vi sinh vật hiếu khí có thể phát triển trên một gram thực phẩm đƣợc tìm thấy từ phép thử theo phƣơng pháp đƣợc mô tả.
Nguyên tắc:
Đồng nhất mẫu với dịch pha loãng bằng máy dập mẫu. Từ dung dịch mẫu sau khi đồng nhất, tiến hành pha loãng thập phân thành nhiều nồng độ. Ở mỗi nồng độ thích hợp, chuyển 1 mL dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa petri, sau đó trộn đều mẫu với môi trƣờng thạch không chọn lọc.
Ủ mẫu trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 1oC trong 72 ± 6 giờ (hoặc có thể ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian theo yêu cầu).
Quy trình phân tích:
Chuẩn bị mẫu:
Cân 1 g mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng SPW (Saline peptone water), đồng nhất mẫu trong khoảng thời gian 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu. Dịch mẫu sau đồng nhất có nồng độ 10-1. Tiếp tục pha loãng thập phân đến nồng độ thích hợp.
Cấy mẫu:
Chuyển 1 mL ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa). Tiếp theo cho vào mỗi đĩa khoảng 15 – 20 mL môi trƣờng PCA (Plate count agar) ở nhiệt độ 45oC. Trộn đều mẫu bằng cách di chuyển đĩa theo hình số 8. Từ giai đoạn pha loãng đến giai đoạn thêm môi trƣờng không quá 20 phút.
Ủ đĩa:
Sau khi môi trƣờng đã đông, lật ngƣợc các đĩa petri ủ trong tủ ủ ở 30 ± 1oC hay ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 ± 6 giờ.
Tính kết quả:
Đếm khuẩn lạc:
Nên chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 – 250 để đếm, nếu có thể nên dùng máy đếm khuẩn lạc để đếm, thời điểm đếm đĩa nằm trong khoảng thời gian 72 ± 6 giờ, nhiệt độ 30 ± 1oC hay nhiệt độ phòng.
Khi đếm khuẩn lạc nên thực hiện dƣới ánh sáng dịu.
Tránh nhầm lẫn giữa khuẩn lạc nhỏ nhƣ đầu ngòi bút và các chấm nhỏ do môi trƣờng không hòa tan, chất béo,... các mẫu nhỏ giống khuẩn thì không đếm nhƣ khuẩn lạc.
Nếu chỉ có một nồng độ cho khoảng đếm thích hợp, tính số đếm trung bình từ hai đĩa của nồng độ đó và ghi nhận kết quả nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Các đĩa có số khuẩn lạc thuộc khoảng 25 – 250. Số khuẩn lạc trên 1 gram mẫu (mL mẫu) tính theo công thức sau:
N = d n n V C ) 1 , 0 ( 1 2 (A.10) Trong đó:
N: Số vi khuẩn có trong mẫu thử (CFU/g)
C: Tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở 2 độ pha loãng kế tiếp nếu các đĩa đều có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250
V: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (mL)
n1: Số đĩa đƣợc đếm ở độ pha loãng thứ nhất
n2: Số đĩa đƣợc đếm ở độ pha loãng thứ hai
d: Nồng độ tƣơng ứng với độ pha loãng thứ nhất
Việc làm tròn số chỉ lấy hai chữ số có ý nghĩa, chỉ áp dụng trong trƣờng hợp xác định vi sinh vật hiếu khí. Khi làm tròn số, nâng chữ số thứ hai lên số có giá trị cao hơn khi số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 và thay các số lẻ bằng số 0. Nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn hoặc bằng 4, thay nó bằng số không và giữ nguyên số thứ hai.
Đối với những trƣờng hợp bất thƣờng (không đĩa nào trong cặp đĩa hoặc chỉ một đĩa có số đếm thích hợp...) có thể đếm và ghi nhận kết quả theo hƣớng dẫn sau (FDA – 1984)
Hai đĩa có số đếm dưới 25:
Đếm số khuẩn lạc thực có trên mỗi đĩa cấy cùng nồng độ đó, tính số khuẩn lạc trung bình cho mỗi đĩa và nhân với số lần pha loãng để có đƣợc ƣớc định của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Đánh dấu kết quả bằng dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ƣớc định tính từ những đĩa nằm ngoài ngƣỡng 25 – 250.
Hai đĩa có số đếm trên 250:
Đếm số khuẩn lạc trên vài vùng đại diện cho số khuẩn lạc của đĩa (1/4, 1/6...diện tích đĩa) rồi quy ra cho diện tích toàn đĩa. Giá trị trung bình của hai đĩa đƣợc ghi nhận nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí ƣớc định. Đánh dấu (*) để biết rằng đây là kết quả ƣớc định tính từ những đĩa nằm ngoài ngƣỡng 25 – 250.
Dạng mọc lan:
Các dạng mọc lan thƣờng thuộc ba loại khác nhau.
(1) Một chuỗi khuẩn lạc không tách rời hẳn khỏi nhau nhƣ đƣợc tạo nên bởi sự phân tách của một cụm vi sinh vật.
(2) Dạng mọc lan trong lớp nƣớc mỏng giữa thạch và đáy đĩa. (3) Dạng mọc lan trong lớp nƣớc mỏng ở rìa hoặc trên mặt thạch.
Nếu các đĩa cấy có dạng mọc lan phát triển nhiều đến mức: a) vùng mọc lan (kể cả vùng mà sự phát triển bị kìm hãm) vƣợt quá 50% diện tích đĩa; hoặc b) vùng mà sự phát triển bị kìm hãm vƣợt quá 25% diện tích đĩa đều đƣợc ghi nhận là đĩa mọc lan. Xác định số đếm trung bình cho mỗi nồng độ, ghi nhận trung bình số học của các giá trị này nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Khi cần phải đếm những đĩa chứa dạng mọc lan không bị loại bởi kiểu a và b nói trên, đếm mỗi dạng mọc lan thuộc 3 kiểu trên nhƣ từ một nguồn. Đối với kiểu 1, nếu chỉ 1 chuỗi thì đếm nhƣ một khuẩn lạc đơn. Nếu có một hay vài chuỗi có vẻ nhƣ phát triển từ những nguồn khác nhau thì đếm mỗi nguồn nhƣ 1 khuẩn lạc riêng biệt. Không đƣợc đếm mỗi nhóm sinh trƣởng riêng biệt trong một chuỗi kiểu này nhƣ một khuẩn lạc tách rời. Dạng 2 và 3 thƣờng sinh ra những khuẩn lạc tách rời và đƣợc đếm nhƣ những khuẩn lạc riêng biệt. Kết hợp các số đếm từ dạng mọc lan và số đếm khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Đĩa không có khuẩn lạc
Khi trên các đĩa từ mọi nồng độ pha loãng đều không có khuẩn lạc nào, ghi kết quả tổng số vi sinh vật ít hơn 1 lần nồng độ pha loãng thấp nhất đã đƣợc sử dụng. Đánh dấu (*) để biết kết quả này là ƣớc định do số đếm nằm ngoài ngƣỡng 25 – 250.
Một đĩa thuộc khoãng 25 – 250, đĩa thứ hai quá 250
Đếm cả hai đĩa, dùng cả kết quả đĩa có số khuẩn lạc quá 250 để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, mỗi nồng độ 1 đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 – 250
Khi 1 đĩa của 1 nồng độ nằm trong ngƣỡng 25 – 250, đĩa thứ hai có dƣới 25 hoặc 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng cả 4 số đếm để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, một nồng độ có 2 đĩa trong ngưỡng, một nồng độ chỉ có 1 đĩa trong ngưỡng 25 – 250
Khi cả 3 đĩa của 1 nồng độ chứa 25 – 250 khuẩn lạc và chỉ 1 đĩa của nồng độ khác chứa 25 – 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng kết quả của cả đĩa dƣới 25 lẫn đĩa trên 250 khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
PHỤ LỤC B
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÔNG KÊ
B.1. Kết quả phân tích thống kê thí nghiệm ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng – muối tới giá trị cảm quan của sản phẩm đƣờng – muối tới giá trị cảm quan của sản phẩm
Bảng B.1. Bảng điểm trung bình có trọng lƣợng của kết quả đánh giá cảm quan, ảnh hƣởng của hàm lƣợng muối – đƣờng tới giá trị cảm quan của sản phẩm Mẫu lần lặp lại màu sắc cấu trúc mùi vị ĐTBCTL trung bình độ lệch chuẩn Mẫu 1 1 5.848 3.44 4.128 2.904 16.32 15.91 0.37 2 5.44 3.44 3.936 2.992 15.81 3 5.848 3.12 3.552 3.08 15.60 Mẫu 2 1 5.576 3.44 4.128 3.08 16.22 15.28 0.99 2 5.168 3.44 3.936 2.816 15.36 3 5.168 2.64 3.36 3.08 14.25 Mẫu 3 1 4.76 3.12 3.936 2.64 14.46 14.70 1.60 2 5.44 3.44 3.84 3.256 15.98 3 4.76 2.48 3.072 2.464 12.78 Mẫu 4 1 5.304 3.36 4.032 3.608 16.30 16.21 0.53 2 5.44 3.52 4.032 3.696 16.69 3 5.168 2.56 4.128 3.784 15.64 Mẫu 5 1 5.032 3.28 3.84 2.728 14.88 15.33 0.88 2 5.44 3.44 4.032 3.432 16.34 3 5.576 2.56 3.648 2.992 14.78 Mẫu 6 1 5.304 3.2 3.936 2.904 15.34 15.06 0.76 2 5.44 3.2 3.744 3.256 15.64 3 5.032 2.72 3.552 2.904 14.21 Mẫu 7 1 5.44 3.12 4.032 3.52 16.11 15.82 0.97
2 5.44 3.44 4.032 3.696 16.61 3 4.352 2.72 4.224 3.432 14.73 Mẫu 8 1 6.12 3.52 4.416 4.136 18.19 18.19 0.09 2 6.12 3.52 4.32 4.136 18.10 3 6.12 3.52 4.416 4.224 18.28 Mẫu 9 1 5.712 3.36 4.128 3.52 16.72 16.26 0.42 2 5.168 3.44 4.032 3.256 15.90 3 5.576 2.96 3.84 3.784 16.16
Bảng B.2. Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng của hàm lƣợng muối – đƣờng tới giá trị cảm quan của sản phẩm
Summary of all Effects; design: (nam1.sta) 1-DUONG, 2-
MUOI
df MS df MS
Effect Effect Error Error F p-level
1 2 7.318203 4 2.839224 2.577537 0.190896
2 2 2.872329 4 2.839224 1.01166 0.44101
12 4 2.839224 18 0.893822 3.176499 0.038616
Bảng B.3. Kiểm định Duncan ảnh hƣởng của hàm lƣợng muối - đƣờng đến giá trị cảm quan của sản phẩm
Duncan test; TB (nam1.sta) Probabilities for Post Hoc Tests
{1} {2} {3} {4} {5} {6} {7} {8} {9} 15.83200 15.26400 14.40267 16.24800 15.26933 15.00267 15.89333 18.44800 16.26933 d8 m2 {1} 0.495908 0.111472 0.617135 0.475604 0.33739 0.937645 0.00604 0.610269 d8 m4 {2} 0.495908 0.30505 0.2657 0.994676 0.739003 0.46462 0.00158 0.261353 d8 m6 {3} 0.111472 0.30505 0.048473 0.31656 0.447263 0.102078 0.000193 0.047804 d10 m2 {4} 0.617135 0.2657 0.048473 0.259531 0.167814 0.651549 0.013812 0.978368 d10 m4 {5} 0.475604 0.994676 0.31656 0.259531 0.748315 0.454869 0.001461 0.258238 d10 m6 {6} 0.33739 0.739003 0.447263 0.167814 0.748315 0.31239 0.000846 0.16454 d12 m2 {7} 0.937645 0.46462 0.102078 0.651549 0.454869 0.31239 0.006268 0.651216 d12 m4 {8} 0.00604 0.00158 0.000193 0.013812 0.001461 0.000846 0.006268 0.011441 d12 m6 {9} 0.610269 0.261353 0.047804 0.978368 0.258238 0.16454 0.651216 0.011441
B.2. Kết quả phân tích thống kê thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt độ sấy tới ẩm độ và giá trị cảm quan của sản phẩm. nhiệt độ sấy tới ẩm độ và giá trị cảm quan của sản phẩm.