Nguyên tắc:
Ở nhiệt độ cao, dƣới tác dụng của H2SO4 đậm đặc và có chất xúc tác, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa, carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, còn gốc amin thì bị oxy hóa và giải phóng ra NH3, NH3 tác dụng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đây là giai đoạn công phá đạm trong mẫu.
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
Trong quá trình chƣng cất, (NH4)2SO4 tác dụng với NaOH dƣ và giải phóng ra NH3
(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + H2O
NH3 sinh ra sẽ hấp thụ bằng dung dịch axit boric tạo thành tetraborat amon. Sau đó chuẩn độ dung dịch tetraborat amon bằng dung dịch chuẩn H2SO4, NH3 đƣợc giải phóng và xác định đƣợc lƣợng nitơ, theo các phản ứng sau:
NH3 + H2O NH4OH + H+
2NH4OH + 4H3BO4 (NH4)2B4O7 + 7H2O
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO4 Tính đƣợc % nitơ có trong mẫu nhân với 6,25 sẽ suy ra đƣợc % protein thô. Chỉ số này tùy thuộc vào tỉ lệ của các hợp chất nitơ có trong protein, nói cách khác tùy thuộc vào nguồn gốc của protein (ví dụ: protein trong sữa: 6,38; ngũ cốc: 5,9; gelatin: 5,55; hạt có dầu: 5,4). Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng dùng chỉ số chung là 6,25.
Các bước tiến hành:
Công phá đạm:
Cân 0,2 g mẫu cho vào ống Kjeldal, đặt ống vào trong kệ nhôm.
Cho vào ống lần lƣợt 10 mL H2O2 và 10 mL H2SO4 đậm đặc, để yên 5 phút.
Đặt cả kệ nhôm vào bộ phận công phá đạm. Mở vòi nƣớc và bật máy. Chỉnh nhiệt độ ở 4 mức:
200oC trong 20 phút
300oC trong 20 phút
370oC trong 20 phút
Tắt máy, khoảng 30 phút sau, tắt nƣớc, lấy kệ đỡ ra và chờ nguội hẳn. Nếu dung dịch trong ống nghiệm có màu trắng là quá trình công phá đạm xãy ra hoàn toàn, nếu còn màu vàng thì thêm 5 mL H2O2 và đặt kệ nhôm vào trong bộ phận công phá đạm tiến hành công phá lại nhƣ trên.
Chưng cất:
Kiểm tra NaOH, nƣớc cất trƣớc khi chƣng cất.
Đặt ống nghiệm chứa dung dịch (NH4)2SO4 đã công phá đạm vào đúng vị trí ở hệ thống chƣng cất đạm.
Bên dƣới hệ thống chƣng cất, đặt bình tam giác chứa 10ml axit boric 2%.
Bật máy, đợi khi xuất hiện chữ P thì bấm nút RUN.
Máy chạy khoảng 5 phút, khi xuất hiện chữ “END” thì tắt. Dung dịch trong bình tam giác lúc này có màu xanh.
Chuẩn độ:
Cho từng giọt dung dịch H2SO4 0,1N từ ống buret vào bình tam giác và lắc đều, nhẹ đến khi dung dịch vừa chuyển sang màu hồng nhạt thì dừng lại. Ghi thể tích dung dịch H2SO4 0,1N vừa chuẩn độ.
Cách tính: 100 * % * 0014 , 0 * ) ( % Dr m V V N o
(mẫu khô) (A.4)
Hoặc % ( )*0,0014*100 m V V N o (mẫu ƣớt) (A.5) %CP = %N * 6,25 (A.6) Trong đó: %CP: % protein thô Vo: Thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ mẫu trắng
V: Thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ mẫu đang phân tích
m: Trọng lƣợng mẫu (g)
%Dr: % độ khô (= 100% - độ ẩm%)
0,0014: số g nitơ ứng với 1mL H2SO4 0,1N dùng chuẩn độ