Nordic Commoittee Food Analysis- Ủy Ban Phân Tích Thực Phẩm Bắc Âu)
Phạm vi áp dụng:
Phƣơng pháp này thích hợp cho việc xác định vi sinh vật hiếu khí có thể phát triển trong thực phẩm và có thể đƣợc áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.
Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật sinh trƣởng ở điều kiện hiếu khí khi phép thử đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp đƣợc mô tả.
Tổng số khuẩn lạc hiếu khí là số vi sinh vật hiếu khí có thể phát triển trên một gram thực phẩm đƣợc tìm thấy từ phép thử theo phƣơng pháp đƣợc mô tả.
Nguyên tắc:
Đồng nhất mẫu với dịch pha loãng bằng máy dập mẫu. Từ dung dịch mẫu sau khi đồng nhất, tiến hành pha loãng thập phân thành nhiều nồng độ. Ở mỗi nồng độ thích hợp, chuyển 1 mL dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa petri, sau đó trộn đều mẫu với môi trƣờng thạch không chọn lọc.
Ủ mẫu trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 1oC trong 72 ± 6 giờ (hoặc có thể ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian theo yêu cầu).
Quy trình phân tích:
Chuẩn bị mẫu:
Cân 1 g mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng SPW (Saline peptone water), đồng nhất mẫu trong khoảng thời gian 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu. Dịch mẫu sau đồng nhất có nồng độ 10-1. Tiếp tục pha loãng thập phân đến nồng độ thích hợp.
Cấy mẫu:
Chuyển 1 mL ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa). Tiếp theo cho vào mỗi đĩa khoảng 15 – 20 mL môi trƣờng PCA (Plate count agar) ở nhiệt độ 45oC. Trộn đều mẫu bằng cách di chuyển đĩa theo hình số 8. Từ giai đoạn pha loãng đến giai đoạn thêm môi trƣờng không quá 20 phút.
Ủ đĩa:
Sau khi môi trƣờng đã đông, lật ngƣợc các đĩa petri ủ trong tủ ủ ở 30 ± 1oC hay ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 ± 6 giờ.
Tính kết quả:
Đếm khuẩn lạc:
Nên chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 – 250 để đếm, nếu có thể nên dùng máy đếm khuẩn lạc để đếm, thời điểm đếm đĩa nằm trong khoảng thời gian 72 ± 6 giờ, nhiệt độ 30 ± 1oC hay nhiệt độ phòng.
Khi đếm khuẩn lạc nên thực hiện dƣới ánh sáng dịu.
Tránh nhầm lẫn giữa khuẩn lạc nhỏ nhƣ đầu ngòi bút và các chấm nhỏ do môi trƣờng không hòa tan, chất béo,... các mẫu nhỏ giống khuẩn thì không đếm nhƣ khuẩn lạc.
Nếu chỉ có một nồng độ cho khoảng đếm thích hợp, tính số đếm trung bình từ hai đĩa của nồng độ đó và ghi nhận kết quả nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Các đĩa có số khuẩn lạc thuộc khoảng 25 – 250. Số khuẩn lạc trên 1 gram mẫu (mL mẫu) tính theo công thức sau:
N = d n n V C ) 1 , 0 ( 1 2 (A.10) Trong đó:
N: Số vi khuẩn có trong mẫu thử (CFU/g)
C: Tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở 2 độ pha loãng kế tiếp nếu các đĩa đều có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250
V: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (mL)
n1: Số đĩa đƣợc đếm ở độ pha loãng thứ nhất
n2: Số đĩa đƣợc đếm ở độ pha loãng thứ hai
d: Nồng độ tƣơng ứng với độ pha loãng thứ nhất
Việc làm tròn số chỉ lấy hai chữ số có ý nghĩa, chỉ áp dụng trong trƣờng hợp xác định vi sinh vật hiếu khí. Khi làm tròn số, nâng chữ số thứ hai lên số có giá trị cao hơn khi số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 và thay các số lẻ bằng số 0. Nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn hoặc bằng 4, thay nó bằng số không và giữ nguyên số thứ hai.
Đối với những trƣờng hợp bất thƣờng (không đĩa nào trong cặp đĩa hoặc chỉ một đĩa có số đếm thích hợp...) có thể đếm và ghi nhận kết quả theo hƣớng dẫn sau (FDA – 1984)
Hai đĩa có số đếm dưới 25:
Đếm số khuẩn lạc thực có trên mỗi đĩa cấy cùng nồng độ đó, tính số khuẩn lạc trung bình cho mỗi đĩa và nhân với số lần pha loãng để có đƣợc ƣớc định của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Đánh dấu kết quả bằng dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ƣớc định tính từ những đĩa nằm ngoài ngƣỡng 25 – 250.
Hai đĩa có số đếm trên 250:
Đếm số khuẩn lạc trên vài vùng đại diện cho số khuẩn lạc của đĩa (1/4, 1/6...diện tích đĩa) rồi quy ra cho diện tích toàn đĩa. Giá trị trung bình của hai đĩa đƣợc ghi nhận nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí ƣớc định. Đánh dấu (*) để biết rằng đây là kết quả ƣớc định tính từ những đĩa nằm ngoài ngƣỡng 25 – 250.
Dạng mọc lan:
Các dạng mọc lan thƣờng thuộc ba loại khác nhau.
(1) Một chuỗi khuẩn lạc không tách rời hẳn khỏi nhau nhƣ đƣợc tạo nên bởi sự phân tách của một cụm vi sinh vật.
(2) Dạng mọc lan trong lớp nƣớc mỏng giữa thạch và đáy đĩa. (3) Dạng mọc lan trong lớp nƣớc mỏng ở rìa hoặc trên mặt thạch.
Nếu các đĩa cấy có dạng mọc lan phát triển nhiều đến mức: a) vùng mọc lan (kể cả vùng mà sự phát triển bị kìm hãm) vƣợt quá 50% diện tích đĩa; hoặc b) vùng mà sự phát triển bị kìm hãm vƣợt quá 25% diện tích đĩa đều đƣợc ghi nhận là đĩa mọc lan. Xác định số đếm trung bình cho mỗi nồng độ, ghi nhận trung bình số học của các giá trị này nhƣ tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Khi cần phải đếm những đĩa chứa dạng mọc lan không bị loại bởi kiểu a và b nói trên, đếm mỗi dạng mọc lan thuộc 3 kiểu trên nhƣ từ một nguồn. Đối với kiểu 1, nếu chỉ 1 chuỗi thì đếm nhƣ một khuẩn lạc đơn. Nếu có một hay vài chuỗi có vẻ nhƣ phát triển từ những nguồn khác nhau thì đếm mỗi nguồn nhƣ 1 khuẩn lạc riêng biệt. Không đƣợc đếm mỗi nhóm sinh trƣởng riêng biệt trong một chuỗi kiểu này nhƣ một khuẩn lạc tách rời. Dạng 2 và 3 thƣờng sinh ra những khuẩn lạc tách rời và đƣợc đếm nhƣ những khuẩn lạc riêng biệt. Kết hợp các số đếm từ dạng mọc lan và số đếm khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Đĩa không có khuẩn lạc
Khi trên các đĩa từ mọi nồng độ pha loãng đều không có khuẩn lạc nào, ghi kết quả tổng số vi sinh vật ít hơn 1 lần nồng độ pha loãng thấp nhất đã đƣợc sử dụng. Đánh dấu (*) để biết kết quả này là ƣớc định do số đếm nằm ngoài ngƣỡng 25 – 250.
Một đĩa thuộc khoãng 25 – 250, đĩa thứ hai quá 250
Đếm cả hai đĩa, dùng cả kết quả đĩa có số khuẩn lạc quá 250 để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, mỗi nồng độ 1 đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 – 250
Khi 1 đĩa của 1 nồng độ nằm trong ngƣỡng 25 – 250, đĩa thứ hai có dƣới 25 hoặc 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng cả 4 số đếm để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, một nồng độ có 2 đĩa trong ngưỡng, một nồng độ chỉ có 1 đĩa trong ngưỡng 25 – 250
Khi cả 3 đĩa của 1 nồng độ chứa 25 – 250 khuẩn lạc và chỉ 1 đĩa của nồng độ khác chứa 25 – 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng kết quả của cả đĩa dƣới 25 lẫn đĩa trên 250 khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
PHỤ LỤC B
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÔNG KÊ