Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Đức) Máy đo độ Brix (ATALA, Nhật bản)
Máy đo pH (HANA pH 212, Trung Quốc) Tủủ Sanyo
Tủ cấy
Máy ép trái cây Tủ sấy mẫu
Thiết bị thanh trùng
Water bath (Mermert, Đức)
Micropipet 10 – 100 µL, 20 – 200 µL, 100 – 1000 µL
Ống nghiệm có nắp, đũa và que cấy, đĩa petri, bình tam giác 100mL, 250 mL, 500 mL và 1000 mL 3.1.3 Hóa chất Cồn 70o Cồn 96o H2SO4, HCl đậm đặc (Merck ) H2SO4 0,1N (Merck) Chì acetate (Merck ) Na2SO4 (Merck )
Thuốc thử methylen xanh, phenolphtalein (Merck ) NaCl (Merck)
NaH2PO4.2H20 (Merck) Acid citric (Merck)
Pectin táo DE = 75% (Sigma)
Môi trường PDA (Merck)Một số hóa chất cần thiết khác sử dụng trong phân tích.
3.1.4 Đối tượng nghiên cứu
Nấm sợi Aspergillus niger đã được phân lập và tuyển chọn phù hợp cho quá trình nuôi cấy sinh pectin methylesterase.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu
Bã táo (Ziziphus nummularia): Táo sau khi ép lấy nước, phần bã còn lại được cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 70ºC. Tiến hành sấy mẫu trong khoảng 12 giờđến độ ẩm 4,0 ± 0,5%. Bã táo khô được nghiền thành bột và đóng trong các bao PE nhỏ hay để trong keo thủy tinh cách ẩm (Joshi et al., 2006).
Vỏ bưởi (Citrus maxima): vỏ bưởi tươi (phần vỏ xanh bên ngoài), rửa sạch, cắt nhỏ, sư dụng ngay (điều chỉnh độ ẩm của vỏ bưởi cho tất cả các nghiệm thức khảo sát là 75%).
Chủng vi sinh vật: Nấm mốc A.niger So2 được chọn lựa ra từ nhiều chủng khác nhau, đã phân lập và được nuôi cấy trên môi trường rắn, chọn chủng sinh PME có hoạt tính cao nhất. Cho 5 mL dung dịch NaCl 0,025M vào ống nghiệm A.niger đã được nuôi cấy sau 4 ngày để thu nhận dung dịch có chứa bào tử nấm A.niger. Đo độ truyền quang %T của Aspergillus niger ở bước sóng 530 nm để xác định mật số trước khi pha loãng với nước cất đến mức độ mong muốn (105 bào tử/mL). Lấy 2 mL huyền phù nấm mốc cho vào các bình tam giác có sẵn cơ chất.
3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả
Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích, đo đạc theo phương pháp được tổng hợp ở bảng 3.
Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu
Chỉ tiêu Phương pháp
Hoạt tính của PME (U/mL) Phương pháp chuẩn độ pH (theo Crelier et al, 1995; trích
dẫn bởi Duvetter, 2007), sử dụng pectin táo (DE 75%) trong NaCl 0,12M làm cơ chất phản ứng, NaOH 0,01N làm dung dịch chuẩn độ.
Hàm lượng protein tổng (mg/mL)
Phương pháp Bradford (1976), sử dụng bovine serum albumin (BSA) làm đường chuẩn, với chỉ thị màu Coomassie Brillant Blue và đo ở bước sóng 595 nm. Hiệu suất thu hồi PME, Y% 100 (%) 0 1 × = TA TA Y
TA0: Tổng hoạt tính PME có trong mẫu thô (U)
TA1: Tổng hoạt tính PME có trong mẫu sau khi hòa tan kết tủa (U) Hoạt tính riêng S (U/mg) protein A S C = A: Hoạt tính PME (U/mL)
Cprotein: Nồng độ protein trong mẫu tương ứng (mg/mL)
3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả
Phân tích phương sai (ANOVA) theo kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức. Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Statgraphic 4.0.
3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.1 Phân tích thành phần hóa học của cơ chất lên men
Mục đích : Xác định các thành phần hóa học của bã táo và vỏ bưởi, làm cơ sở cho
việc tính toán tỷ lệ phối trộn và điều chỉnh độẩm môi trường thích hợp.
Các chỉ tiêu cần khảo sát: Độ ẩm, đường hòa tan, hàm lượng pectin và xác định mức độ ester hóa của pectin (độ DE), protein
Số lần phân tích cho một chỉ tiêu: 3 ÷ 5 lần.
3.3.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giữa bã táo và vỏ bưởi
Mục đích: Xác định được tỷ lệ phối trộn thành phần cơ chất với giá trị dinh dưỡng thích hợp (độ ẩm, hàm lượng pectin, DE, lượng đường hòa tan) cho quá trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger đạt hiệu quả cao.
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố A: Tỷ lệ của bã táo: vỏ bưởi sử dụng
A 1: 10 : 1 A 5: 5 : 5 A2 : 8 : 2 A6: 4 : 6 A3 : 7 : 3 A7 : 1 : 10 A 4: 6 : 4
Nhân tố cốđịnh: Độẩm môi trường (60%)
Số nghiệm thức thí nghiệm : 7 x 1= 6 nghiệm thức Số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 = 18 mẫu
Sơđồ bố trí thí nghiệm
Hình 9 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Tiến hành thí nghiệm
Cân 5 g hỗn hợp bã táo và vỏ bưởi tươi ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau cho vào các bình tam giác 250 mL. Ở thí nghiệm này, nước cất được sử dụng để điều chỉnh độ ẩm môi trường đến 60% đồng thời bổ sung khoáng vào môi trường nuôi cấy bằng cách hoà tan vào nước cất trên. Khoáng bổ sung bao gồm: CaCl2; ure; MgCl2 với
Ủ
Aspergillus niger
Nước
Môi trường nuôi cấy
Thanh trùng Làm nguội Cấy vi sinh vật Trích ly enzyme Đo thể tích, hoạt tính Điều chỉnh độẩm Tỉ lệ táo: bưởi Bổ sung khoáng
tỷ lệ: 0,15% CaCl2; 0,1% ure ; 0,5%MgCl2 theo khối lượng cơ chất (w/w) . Thanh trùng các bình tam giác chứa cơ chất ở 121°C trong 15 phút. Làm mát các bình sau khi thanh trùng, cho 10% (w/v) huyền phù bào tử nấm mốc vào mỗi bình cấy (105 bào tử/mL) và ủở nhiệt độ 37°C trong các khoảng thời gian bố trí như trên.
Sau thời gian ủ 96 giờ trích lấy dịch chứa enzyme PME khi lên men bằng nước (khuấy gián đoạn trong 1 giờ) (Joshi, 2006). Tiến hành thu dịch chứa enzyme tương ứng với mức thời gian khảo sát để đo đạc PME có trong dịch trích.
Xác định lại DE và lượng pectin trong mẫu sau khi thanh trùng.
Kết quả thu nhận
Thành phần cơ chất (hàm lượng pectin, đường hòa tan sử dụng) thích hợp cho quá trình lên hoạt tính PME cao nhất được chọn làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủđến khả năng sinh tổng hợp PME từ
A.niger
Mục đích: Xác định thời gian ủ thích hợp cho sự sinh tổng hợp PME từ A.niger là
tốt nhất.
Bố trí thí nghiệm
Nhân tố B: Thời gian ủ, có 5 mức độ thời gian ủđược khảo sát
B1: 48 giờ B2: 72 giờ B3: 96 giờ B4: 120 giờ
Số nghiệm thức: 4 x 1= 4 nghiệm thức Số mẫu thí nghiệm: 4 x 3 = 18 mẫu
Tiến hành thí nghiệm
Khảo sát được thực hiện dựa trên kết quả tối ưu của thí nghiệm 1. Sau thời gian ủ tương ứng 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, và 120 giờ, trích lấy dịch chứa enzyme và xác định hoạt tính.
Xác định lại độẩm, pH, DE và lượng pectin còn trong mẫu sau khi ủ.
Kết quả thu nhận
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Xác định thành phần hoá học (pectin, DE, đường tổng số, đạm ), và độẩm trong cơ chất lên men ẩm trong cơ chất lên men
PME có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của acid polygalacturonic
(Ishi et al., 1979; Limberg et al., 2000). Chính vì thế, môi trường nuôi cấy giàu pectin với mức độ ester hóa (độ DE) cao sẽ trợ giúp hiệu quả cho việc thúc đẩy quá trình lên men sinh PME từ nấm mốc. Thành phần pectin và mức độ ester hóa của 2 nguyên liệu chính được xác định, tạo cơ sở cho nghiên cứu sinh tổng hợp PME tiếp theo. Kết quảđược tổng hợp theo bảng 4.
Bảng 4. Hàm lượng đường, đạm, pectin, DE và độ ẩm của cơ chất lên men.
Nguyên liệu Ẩm Đường Pectin DE Đạm
Táo khô 4,29 ± 0,19 47,58 ± 2,82 34,83 ± 0,67 67,94 ± 5,63 4,93 ± 0,08 Bưởi tươi 75,61 ± 3,20 3,73 ± 0,83 0,53 ± 0,07 84,77 ± 6,06 0,15 ±0,04
Bưởi khô 4,85 ± 0,20 14,52 ±0,79 1,88 ± 0,24 84,77 ± 6,06 0,58 ± 0,07
Từ kết quả thu được ở bảng trên có thể nhận thấy, hàm lượng pectin trong bã táo khô có giá trị (34,83 ± 0,67%), đây chính là điều kiện thuận lợi cho hoạt động sinh tổng hợp PME từ quá trình nuôi cấy nấm mốc A.niger. Tuy nhiên, mức độ ester hóa của táo ta là 67,94 ± 5,63 %, thấp hơn so với các giống táo khác đã được khảo sát trên thế giới (Công bố của Wolfgang vào năm 2004 cho thấy, DE của táo thường dao động ở tỉ lệ 80 ÷ 92%; Rao &Maini, 1999 tìm ra giá trị DE của táo là 74,0%).
Trong khi đó, hàm lượng pectin thu được từ vỏ bưởi khá thấp ( pectin trong vỏ bưởi tươi chiếm 0,53 ± 0,07% và 1,88 ± 0,24% trong vỏ bưởi khô), độ ester hóa cao và nằm trong khoãng 84,77%. Nghiên cứu trước đó của Phuangsinou et al.
(2008) cho thấy, một giống bưởi lai tạo tại địa phương (Thái Lan) có thể có độ ester hóa (DE) rất cao (91,4%). Tuy nhiên, trong bưởi hàm lượng protein rất thấp (0,15% ± 0,04), và không đủ số chất dinh dưỡng cho nấm mốc phát triển. Bù lại thì độ DE và hàm lượng pectin của cơ chất này cao. Đây chính là thông tin hữu hiệu cho quá trình sinh PME từ nấm mốc A.niger. Kết quả cho phép nghĩ đến sự kết hợp của bã táo và vỏ bưởi nhằm cải thiện thành phần môi trường lên men.
4.2 Ảnh của tỷ lệ phối trộn của bã táo và vỏ bưởi đến khả năng sinh tổng hợp PME từ nấm mốc A.niger hợp PME từ nấm mốc A.niger
Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng như các enzyme khác từ vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các
chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Tuy nhiên, để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Ở điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý của chúng (tổng hợp enzyme “bản thể”). Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải tiến hành quá trình nuôi cấy thích hợp với sự tham gia của cơ chất cảm ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004;
Favelar – Torres et al., 2006).
Thí nghiệm thăm dò cho thấy, việc sử dụng vỏ bưởi khô có cùng độẩm với bã táo không tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của nấm mốc. Vỏ bưởi sấy khô, nghiền mịn hút nước và trương nở mạnh, làm giảm độ xốp của môi trường lên men. Việc sử dụng thêm các thành phần tạo độ thoáng khí cho môi trường lên men như vỏ trấu vẫn không cho hiệu quả cải thiện chất lượng đáng kể. Trên cơ sở đó, thí nghiệm tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn của bã táo khô và vỏ bưởi tươi đến hiệu quả thu nhận enzyme PME từ Aspergillus niger. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5: Hoạt tính enzyme theo tỷ lệ cơ chất
Tỉ lệ bã táo : vỏ bưởi (%, w/w) Hoạt tính PME (U/mL)
Táo (10:1) 4,83a ± 0,29 8:2 22,50b ± 0,87 7:3 25,67c ± 0,58 6:4 29,73d ± 0,64 5:5 41,14 e± 4,57 4:6 20,57b ± 0,51 Bưởi(1:10) 1,90a ± 0,17
a b e d c b a 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 10:0 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 0:10 Tỷ lệ bã táo: vỏ bưởi H o ạ t tí n h P M E ( U /m L )
Hình 10: Đồ thị biểu diễn hoạt tính PME theo tỷ lệ cơ chất
Kết quả cho thấy, hoạt tính PME ở các nghiệm thức sử dụng kết hợp hai loại cơ chất trên (bã táo,vỏ bưởi) cao hơn so với hai mẫu đối chứng và tỷ lệ phối trộn giữa bã táo và vỏ bưởi là 5:5 thì khả năng sinh tổng hợp PME từ nấm mốc là cao nhất. Việc sử dụng kết hợp vỏ bưởi tươi làm cơ chất cho quá trình lên men góp phần cải thiện độ xốp của môi trường - cải thiện tốc độ trao đổi khí, 50% (w/w) bã táo kết hợp với 50% vỏ bưởi và được pha loãng với nước ở tỉ lệ 1: 2 (tạo độ ẩm 60%) là điều kiện tốt nhất cho việc sản xuất PME từ A.niger ở phương thức nuôi cấy trên môi trường rắn. Nấm mốc A.niger là loại hiếu khí nên điều kiện thoáng khí càng nhiều càng phát triển tốt (Bayoumi et al. 2008). Kết quả nghiên cứu của Díaz (2009) cũng cho thấy, hoạt tính của các loại enzyme thủy phân từ A.awamori đạt cao nhất trong quá trình lên men sử dụng cơ chất là hỗn hợp bã nho và vỏ cam với tỉ lệ 1:1.
Điều đó chứng tỏ ở tỉ lệ này, hàm lượng pectin cao trong bã táo và mức độ ester hóa cao của pectin trong vỏ bưởi là nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp nhất cho
A.niger phát triển và sinh tổng hợp PME. Việc gia tăng nồng độ cơ chất pectin có
hiệu quả rất tích cực trong việc đẩy nhanh tốc độ lên men và gia tăng hoạt tính enzyme pectin esterase (Maldonad & Callieri, 2005). Bên cạnh việc gia tăng hàm lượng pectin, mức độ este hóa cao của pectin cũng là một chỉ số rất quan trọng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt động sinh tổng hợp PME của A.niger (Grebechova,
2007).
Hàm lượng pectin, DE trong mẫu lên men ngay sau khi thanh trùng đã được xác định lại và thống kê ở bảng 6.
Bảng 6 : Hàm lượng pectin, DE theo từng tỷ lệ cơ chất sau khi thanh trùng
Tỷ lệ cơ chất Pectin(%) DE(%)
10:1 34,83g ± 0,67 67,94a ± 5,36 8:2 27,92f ± 0,46 68,83ab ± 1,38 7:3 24,52e ± 0,27 70,82abc ± 1,97 6:4 21,11d ± 0,43 72,82bc ± 2,55 5:5 17,68c ± 0,37 74,81bc ± 3,14 4:6 14,25 b± 0,31 76,80 c± 3,72 1:10 0,53a ± 0,07 84,77 d± 6,06
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%
Từ kết quả bảng 6 cho thấy rằng khi giảm tỷ lệ bã táo trong thành phần môi trường lên men thì hàm lượng pectin cũng giảm dần. Điều đó cho thấy nguyên liệu bã táo là thành phần chính cung cấp pectin và là một trong những cơ chất cảm ứng thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME. Bên cạnh đó, chỉ số ester hoá (DE) của pectin cũng là một yếu tố quan trọng giúp kích hoạt quá trình sinh tổng PME. Khi thành phần cơ chất có độ ester hoá càng lớn thì hiệu quả quá trình sinh PME từ nấm mốc A.niger càng cao. Chính vì vậy, khi kết với pectin có DE cao trong nguồn nguyên liệu là vỏ bưởi sẽ tăng hiệu quả của quá trình lên men. Kết quả là sự phối trộn 2 cơ chất ( táo : bưởi) là 5:5 PME có hoạt tính cao nhất do cả 2 thông số pectin, DE có tỷ lệ cao và hài hoà nhất. Bên cạnh cơ chất thích hợp thì thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh PME.
4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp PME từ
A.niger
Quá trình sinh tổng hợp enzyme phụ thuộc rất lớn vào sự phát triển của tế bào nấm mốc nên thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quan trọng quyết định hoạt tính của enzyme cao hay thấp. Do đó, thí nghiệm được tiến hành để khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy nấm mốc
A.niger (48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) để tìm ra thời điểm nấm mốc phát triển tối ưu để sinh PME có hoạt tính cao. Kết quảđược đo đạc, thống kê và tổng hợp ở bảng 7.
Bảng 7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính PME từ A.niger Thời gian ủ (giờ) Hoạt tính PME (U/mL)
0 giờ 0a
48 giờ 15,21b ± 0,2 72 giờ 22,88c ± 0,18
96 giờ 41,16d ± 4,18
120 giờ 12,80b ± 0,26
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%
Theo bảng 7 ta thấy hoạt tính của enzyme A.niger PME thu được tăng dần khi thời gian ủ kéo dài đến 96 giờ. Sau đó hoạt tính bắt đầu giảm khi thời gian nuôi cấy tăng từ 96 giờ đến 120 giờ. Hoạt tính enzyme cao nhất là ( 41,16U/mL ± 4,18) đạt được ở thời gian ủ là 96 giờ ( 4 ngày).
Kết quả thu được còn cho thấy hoạt tính enzyme thu được liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của tế bào nấm mốc. Điều này có thể được giải thích là do trong 24 giờ sau khi cấy, nấm mốc A.niger đang dần thích nghi với điều kiện môi trường, do đó chúng chưa gia tăng mật số đáng kể. Vì thế, việc thu chế phẩm enzyme ở thời điểm này là quá sớm khiến cho enzyme chưa được tổng hợp nhiều, nên enzyme thu được có hoạt tính khá thấp. Trong 24 giờ sau đó, nấm mốc bắt đầu gia