môi trường trong quá trình lắc cũng ít hơn.
+ Kích thước tế bào vi khuẩn L. acidophilus lớn hơn tế bào B. subtilis natto
nên cũng khó bị rơi ra ngoài môi trường hơn trong quá trình lắc bình lên men.
Kết luận sơ bộ: Số lượng tế bào B. subtilis natto cố định được trong 1g hạt
gel alginate 3% là 4,11 1011 tế bào. Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh thang
(ở 370C, lắc 110 vòng/phút trong 24h), số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1g hạt
gel đã giảm xuống còn 4,47 1010 tế bào và số lượng tế bào B. subtilis natto trong
1 ml dịch nuôi cấy là 5,23 107 tế bào.
3.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trƣờng canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: trƣờng canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt:
3.2.1. Định tính enzyme protease có trong dịch nuôi cấy hạt alginate cố định B. subtilis natto: subtilis natto:
B. subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài B. subtilis. Protease ngoại bào của loài
B. subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vào cuối pha lũy
thừa, cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử [36]. Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới và kết quả của Đào Thị Mai tiến hành trên cùng giống vi khuẩn, protease
tập trung chủ yếu trong phần dịch nổi hay dịch trong [12]. Vi khuẩn Bacillus
subtilis natto được tìm thấy trong món ăn natto là đậu tương lên men, do đó lựa
chọn sữa đậu nành (sản phẩm từ đậu tương) để bổ sung vào môi trường canh thang để khảo sát khả năng sinh enzyme protease từ môi trường nuôi cấy.
Mục tiêu:
Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease khi nuôi cấy hạt alginate cố định B.
subtilis natto trong dịch nuôi cấy với môi trường canh thang và môi trường chứa
26
Tiến hành: Thí nghiệm dựa trên kết quả của nghiên cứu điều kiện lên men
thu sinh khối B. subtilis natto: tiến hành lên men hạt alginate cố định vi sinh vật với
3 môi trường lên men: canh thang, canh thang - sữa đậu nành và sữa đậu nành 20%; lấy mẫu từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24h, 48h, 72h.
- Nhân giống B. subtilis natto trong môi trường canh thang theo phương pháp
nêu ở mục 2.3.1.
- Tạo hạt và nuôi cấy hạt alginate chứa B. subtilis natto trong 3 môi trường:
canh thang, canh thang - sữa đậu nành và sữa đậu nành 20% theo phương pháp nêu
ở mục 2.3.2, ủ trong máy lắc ở 370C, tốc độ 110 vòng/phút.
- Tại mỗi thời điểm 24h, 48h, 72h; thu lấy phần dịch trong.
- Thử khả năng phân giải casein của dịch nuôi cấy với các môi trường khác nhau tại các thời điểm 24h, 48h, 72h theo phương pháp nêu ở mục 2.3.4.
Kết quả :
Bảng 3.2. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h
Thời gian nuôi cấy
Đƣờng kính vòng phân giải casein (mm)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
24h 25,20 18,80 16,40 20,13 0%
48h 27,90 19,50 17,90 21,77 8,15%
72h 21,90 18,75 12,60 17,75 -11,8%
Nhận xét:
Với môi trường nuôi cấy là canh thang, sau 48h nuôi cấy, hạt gel cố định sinh tổng hợp nhiều protease nhất (thể hiện qua đường kính trung bình vòng phân giải casein của dịch lên men sau 24h, 48h, 72h tương ứng là: 20,13mm; 21,77mm;
17,75mm). Hoạt tính enzyme protease do hạt gel cố định B. subtilis natto sinh ra
27
Sau 72h nuôi cấy, hoạt tính enzyme protease do hạt gel cố định sinh ra giảm so với thời điểm 24h và 48h nuôi cấy (thể hiện qua đường kính trung bình vòng phân giải casein của dịch lên men sau 72h nuôi cấy giảm 11,8% so với thời điểm sau 24h nuôi cấy).
Bảng 3.3. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang – sữa đậu nành tại 3 thời điểm 24h,
48h, 72h
Thời gian nuôi cấy
Đƣờng kính vòng phân giải casein (mm)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
24h 25,20 19,40 17,80 20,80 0%
48h 31,35 20,95 18,60 23,63 13,6%
72h 24,10 20,15 13,30 19,18 - 4,81%
Nhận xét:
Với môi trường nuôi cấy là canh thang bổ sung 20% sữa đậu nành, sau 48h nuôi cấy, hạt gel cố định sinh tổng hợp nhiều protease nhất (thể hiện qua đường kính trung bình vòng phân giải casein của dịch lên men sau 24h, 48h, 72h tương ứng là: 20,8mm; 23,63mm; 19,18mm). Hoạt tính enzyme protease do hạt gel cố
định B. subtilis natto sinh ra sau 48h tăng 13,6% so với thời điểm nuôi cấy sau 24h.
Sau 72h nuôi cấy, hoạt tính enzyme protease do hạt gel cố định sinh ra giảm so với thời điểm 24h và 48h nuôi cấy (thể hiện qua đường kính trung bình vòng phân giải casein của dịch lên men sau 72h nuôi cấy giảm 4,81% so với thời điểm sau 24h nuôi cấy).
28
Bảng 3.4. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt calci alginate 3% trong môi trường sữa đậu nành 20% tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h
Thời gian nuôi cấy
Đƣờng kính vòng phân giải casein (mm)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
24h 23,25 17,00 15,40 18,55 0%
48h 27,50 16,60 17,20 20,43 10,13%
72h 17,95 16,10 12,40 15,48 -16,55%
Nhận xét:
Với môi trường nuôi cấy là sữa đậu nành (20%), sau 48h nuôi cấy, hạt gel cố định sinh tổng hợp nhiều protease nhất (thể hiện qua đường kính trung bình vòng phân giải casein của dịch lên men sau 24h, 48h, 72h tương ứng là: 18,55mm;
20,43mm; 15,48mm). Hoạt tính enzyme protease do hạt gel cố định B. subtilis natto
sinh ra sau 48h tăng 10,13% so với thời điểm nuôi cấy sau 24h.
Sau 72h nuôi cấy, hoạt tính enzyme protease do hạt gel cố định sinh ra giảm mạnh so với thời điểm 24h và 48h nuôi cấy (thể hiện qua đường kính trung bình vòng phân giải casein của dịch lên men sau 72h giảm 16,55% so với thời điểm sau 24h nuôi cấy).
Để so sánh hoạt tính enzyme protease trong dịch lên men của môi trường lên
men khác nhau tại các thời điểm khác nhau khi lên men hạt gel cố định B. subtilis
29
Bảng 3.5. So sánh đường kính vòng phân giải casein của enzyme protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau theo thời gian nuôi cấy hạt gel
cố định B. subtilis natto
Môi trƣờng nuôi cấy
Đƣờng kính vòng phân giải casein (mm)
Sau 24h nuôi cấy Sau 48h nuôi cấy Sau 72h nuôi cấy
d(mm) d(mm) d(mm)
MT1 20,13 0% 21,77 0% 17,75 0%
MT2 20,80 3,33% 23,63 8,54% 19,80 11,55%
MT3 18,55 -7,85% 20,43 -6,16% 15,48 -12,79%
Hình 3.1. Biến thiên đường kính vòng phân giải casein của enzymeprotease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau theo thời giannuôi cấy hạt gel
cố định B. subtilis natto 20.13 21.77 17.75 20.8 23.63 19.18 18.55 20.43 15.48 14 16 18 20 22 24 24h 48h 72h MT 1 MT 2 MT 3 Đư ờng kính (m m )
30
Nhận xét :
Hoạt tính của enzyme protease trong dịch lên men của các môi trường được
thể hiện qua đường kính vòng phân giải cơ chất casein. Từ Bảng 3.5 và Hình 3.1
thấy: Hoạt tính enzyme protease có sự thay đổi khi thay đổi thời gian và môi trường nuôi cấy.
Với môi trường nuôi cấy là canh thang bổ sung 20% sữa đậu nành, hạt gel cố
định B. subtilis natto sinh tổng hợp nhiều protease nhất (thể hiện qua đường kính
vòng phân giải casein của dịch lên men trong 3 môi trường: MT 1, MT 2, MT3). Khi bổ sung 20% sữa đậu nành vào môi trường canh thang, đường kính vòng phân giải casein tăng 3,33% sau 24h nuôi cấy, tăng 8,54% sau 48h nuôi cấy và tăng 11,55% sau 72h nuôi cấy so với môi trường canh thang.
Với môi trường nuôi cấy là sữa đậu nành (20%), hoạt tính enzyme protease
do hạt gel cố định B. subtilis natto sinh ra giảm mạnh so với môi trường canh thang
và môi trường canh thang bổ sung 20% sữa đậu nành (thể hiện qua đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men với môi trường sữa đậu nành 20% giảm 7,85% sau 24h nuôi cấy, giảm 6,16% sau 48h nuôi cấy và giảm 12,79% sau 72h nuôi cấy so với môi trường canh thang).
Bàn luận:
- Kết quả so sánh khả năng sinh enzyme protease của hạt gel cố định vi
khuẩn B. subtilis natto khi nuôi cấy sau các khoảng thời gian khác nhau cho thấy:
Sau 48h nuôi cấy, hạt gel cố định B. subtilis natto sinh tổng hợp nhiều protease nhất
(với cả 3 môi trường nuôi cấy: MT1, MT2, MT3), do đó có thể tiến hành thu mẫu và tách chiết enzyme protease tại thời điểm này nhằm thu được nhiều enzyme protease với hoạt tính cao nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn
Thùy Dương cũng với vi khuẩn B. subtilis natto (hoạt tính enzyme protease sau 48h
31
- Kết quả so sánh khả năng sinh enzyme của hạt gel cố định vi khuẩn
B. subtilis natto khi nuôi cấy trong môi trường canh thang và môi trường bổ sung
sữa đậu nành cho thấy: Với môi trường nuôi cấy MT 2, hạt gel cố định B. subtilis
natto sinh tổng hợp được nhiều protease nhất (hoạt tính enzyme protease tăng
8,54% so với môi trường canh thang sau 48h nuôi cấy), do đó có thể tiến hành nuôi cấy hạt gel trong môi trường MT 2 (gồm canh thang bổ sung 20% sữa đậu nành) để lên men, thu nhận và tách chiết protease nhằm thu được nhiều enzyme với hoạt tính
cao nhất. Theo nghiên cứu của Đinh Thu Hương cũng với Bacillus subtilis natto,
khi bổ sung đậu tương ở dạng hạt (2%) và dạng bột (2%) vào môi trường canh thang thì hoạt tính enzyme protease tăng so với môi trường canh thang (17,2% - 25%), trong đó bổ sung bột đậu cho đường kính vòng phân giải lớn hơn bổ sung đậu tương dạng hạt [8]. Như vậy, sữa đậu nành (20%) đã làm tăng khả năng sinh
enzyme protease của hạt gel cố định B. subtilis natto.
- Sau 72h, hoạt tính enzyme protease do hạt gel cố định vi khuẩn đã giảm mạnh (với cả 3 môi trường nuôi cấy). Điều này có thể giải thích bởi nhiều lý do: thành phần môi trường đã thay đổi, lượng dinh dưỡng giảm đi… làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzyme bị bất hoạt. Hơn nữa, có thể xảy ra hiện tượng autolysis (hiện tượng enzyme bị thủy phân) hoặc do vi khuẩn tổng hợp nên các chất kìm hãm trong môi trường nên ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme.
Kết luận sơ bộ:
Tế bào B. subtilis natto được cố định trong hạt calci alginate 3% có khả năng
sinh enzyme protease với hoạt tính tốt. Chọn môi trường canh thang bổ sung 20%
sữa đậu nành là môi trường và 48h là thời gian lên men hạt gel alginate cố định B.
subtilis natto để thu nhận và tách chiết enzyme protease, đồng thời sử dụng cho các
32