trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt.
+ Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy các hạt gel
alginate cố định B. subtilis natto với môi trường canh thang và môi trường chứa sữa
đậu nành.
+ Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt gel
alginate cố định B. subtilis natto ở các thời điểm khác nhau.
+ Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: Xác định số lượng tế bào vi khuẩn B.
subtilis natto giữ lại được trong 1g hạt gel alginate 3% sau khi giữ trong môi trường
17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy chủng Bacillus subtilis natto:
a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng:
Pha môi trường thạch thường (theo mục 2.3.1), khuấy đều, đun cho đồng nhất. Chia môi trường vào trong các ống nghiệm (5 – 6ml/ống), nút kín. Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để nguội cho thạch đông lại. Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi trường mới theo hình ziczac. Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ủ ở
370C/24h. Bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở 4 – 50C.
Việc cấy truyền được thực hiện 1 – 2 tháng/lần [6], [14].
b) Phương pháp nhân giống trong bình nón:
Pha 100ml môi trường canh thang MT 1 cho vào bình nón 250ml, nút kín. Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống nhiệt độ phòng, dùng que cấy vô khuẩn lấy một vòng que cấy
trong ống giống cấy vào môi trường. Nuôi trên máy lắc ở 370C/24h, tốc độ lắc 110
vòng/phút [6], [14].
Thu dịch sinh khối: Ly tâm dịch sinh khối tế bào B. subtilis natto với tốc độ
4000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần dịch trong ở trên đến khi còn 10ml dịch. Votex phần dịch này thu được dịch sinh khối.
c) Phương pháp lên men hiếu khí với các hạt cố định:
Pha 50ml môi trường lên men (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 250ml, nút kín. Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, để môi
trường nguội xuống dưới 400
C, cấy hạt đã tạo ra sang các môi trường lên men với tỷ
lệ cấy truyền là 10% khối lượng hạt tạo được. Nuôi VSV trên máy lắc ở 370C, tốc
18
2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành:
Rửa sạch 80g đậu tương hạt. Ngâm trong nước lạnh trong 12h. Cho đậu tương vào máy làm sữa đậu nành. Đong chính xác 1000ml nước cất vào máy. Khởi động máy, bật máy đến khi đậu tương hoàn toàn mịn thì tắt máy. Giữ sữa đậu nành trong ngăn mát tủ lạnh, sử dụng trong vòng 2 tuần.
2.3.3. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginate: [2]
Pha các dung dịch sau:
200ml dung dịch CaCl2 2%.
400ml dung dịch NaCl 0,9%.
100ml dung dịch Natri alginate 3%.
Đem hấp tiệt trùng các dung dịch trên ở điều kiện 1atm/20 phút, sau đó lấy ra để nguội. Thêm dịch sinh khối đã chuẩn bị ở 2.3.1.b vào bình natri alginate 3%, lắc đều, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 20 phút để tạo hỗn dịch đồng nhất, sau đó để yên 5 phút để loại hết bọt khí.
Dùng pipet Pasteur nhỏ hỗn dịch này vào cốc đựng 50ml dung dịch CaCl2
2% đã tiệt trùng, hạt sẽ tạo thành, để yên 30 phút cho hạt ổn định, rồi rửa hạt 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng.
2.3.4. Phương pháp phá hạt:
Cho 1 gam hạt thu được vào bình nón chứa 100ml dung dịch natri citrate 2% đã được tiệt trùng ở 1atm/20 phút và để nguội. Phá hạt bằng cách khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 20-30 phút ở nhiệt độ phòng cho tới khi các hạt calci alginate tan thành dung dịch đồng nhất trong natri citrate.
19
Nguyên tắc: Dùng casein làm cơ chất, xác định khả năng phân giải protein
của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch [14].
Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% casein và 2% thạch trong cốc có
mỏ 200ml, thêm 10 giọt xanh methylene, khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri đường kính 8,8cm. Khi thạch đông lại thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch. Ủ trong tủ
ấm 370C/24h và đọc kết qủa [15].
2.3.6. Phương pháp xác định số lượng tế bào:
Sử dụng phương pháp pha loãng liên tục: Chuẩn bị số lượng ống nghiệm tương ứng với nồng độ pha loãng. Cho vào mỗi ống nghiệm 9ml NaCl 0,9%, hấp tiệt trùng ở 1atm/20 phút. Để nguội, hút chính xác 1,0ml dung dịch cần pha loãng
cho vào ống nghiệm thứ nhất ta được 10,0ml dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1.
Tiếp tục hút 1,0ml dung dịch trong ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ
hai ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng đến ống thứ n ta
được nồng độ pha loãng 10-n
.
Với tế bào được cố định trong gel alginate, tiến hành phá hạt: 1 gam hạt trong 100ml dung dịch natri citrate 2% (theo phương pháp nêu ở mục 2.3.4) được
dung dịch pha loãng có nồng độ 10-2. Hút chính xác 1,0ml dung dịch trên pha loãng
liên tục tới nồng độ 10-n.
Với dịch chứa tế bào: Hút chính xác 1,0ml dịch lên men pha loãng liên tục
tới nồng độ 10-n cần xác định.
Xác định số lượng tế bào: Phương pháp cấy trộn trong thạch: Hấp tiệt trùng
40ml thạch thường (theo công thức ở mục 2.1.3) ở điều kiện 1150C/20 phút. Để
nguội đến khoảng 500C. Sau đó trộn 1,0ml dịch có nồng độ cần đo đã pha loãng ở
trên vào, lắc đều. Sau đó đổ đều vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 20ml. Để ở tủ ấm 370C.
20
bình số khuẩn lạc trong các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30-300) [3].
Số lượng VSV trong 1g hạt alginate hoặc 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức sau:
X = Trong đó:
X: số VSV có trong 1g hạt hoặc 1ml dịch nuôi cấy
An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10-n
m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g).
2.3.7. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm:
* Cách tính % tăng giảm về đường kính phân giải casein của dịch lên men môi trường thử với môi trường canh thang và dịch lên men các môi trường sau thời gian nuôi cấy khác nhau so với thời gian nuôi cấy 24h:
: % tăng giảm về đường kính phân giải casein của dịch lên men môi trường thử sau so với môi trường canh thang hoặc dịch lên men các môi trường sau thời gian nuôi cấy khác nhau so với thời gian nuôi cấy 24h.
: đường kính vòng phân giải casein của môi trường thử sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau.
: đường kính vòng phân giải casein của môi trường thử sau thời gian nuôi cấy 24h hoặc của môi trường canh thang sau thời gian nuôi cấy khác nhau.
21
22
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel
alginate:
Cố định tế bào là một bước tiến quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung và công nghệ lên men nói riêng. Đã có nhiều nghiên cứu về quá trình cố định tế bào cũng như việc lựa chọn các loài vi khuẩn và dạng cơ chất tham gia vào cố định tế bào. Trong các cơ chất đã được nghiên cứu và ứng dụng trên thực tế như agar, alginate, k-carageenan… thì alginate là cơ chất đem lại khá nhiều ưu điểm. Trong cố định tế bào có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của hạt như: độ bền của hạt, khả năng sống sót của vi khuẩn… Số lượng tế bào được cố định trong các hạt calci alginate là một thông số quan trọng để đánh giá khả năng cố định tế bào của gel calci alginate. Đồng thời từ đó có thể so sánh khả năng lên men của tế bào cố định và tế bào tự do.
Mục tiêu:
- Xác định số lượng tế bào cố định được trong hạt gel alginate trước và sau 24h nuôi cấy.
- Xác định số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy hạt gel ở điều kiện hiếu khí.
Tiến hành:
- Nhân giống vi khuẩn B. subtilis natto trong 100ml môi trường canh thang.
Nuôi trên máy lắc ở 370C trong 24h, tốc độ lắc 110 vòng/phút theo phương pháp ở
mục 2.3.1.
- Cố định tế bào trong hạt calci alginate 3% theo phương pháp ở mục 2.3.2. - Đếm số lượng tế bào trong 1g hạt gel alginate mới tạo theo phương pháp ở mục 2.3.5.
- Nuôi cấy 10% khối lượng hạt gel cố định B. subtilis natto trong môi trường
23
Sau 24h, đếm số lượng tế bào trong 1g hạt gel cố định vi khuẩn đã nuôi cấy và số lượng tế bào trong 1ml dịch nuôi cấy thu được theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5.
Kết quả:
Bảng 3.1. Số lượng tế bào cố định được trong hạt gel alginate và số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí
Số lƣợng tế bào B. subtilis natto s
Trong hạt gel alginate trước khi nuôi
cấy 4,11 10
11 cfu/g 0,15
Trong hạt alginate sau 24h nuôi cấy 4,47 1010 cfu/g 0,21
Trong dịch nuôi cấy hạt gel đã cố
định tế bào sau 24h nuôi cấy 5,23 10
7
cfu/ml 0,25
Nhận xét:
Số lượng tế bào B. subtilis natto cố định được trong 1g hạt gel alginate đạt
giá trị 4,11 1011 tế bào. Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh thang (ở 370C, lắc
110 vòng/phút trong 24h), số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1g hạt gel đã giảm
xuống còn 4,47 1010 tế bào. Điều này chứng tỏ trong quá trình nuôi cấy hạt tế bào
đã bị thất thoát ra khỏi hệ gel vào môi trường nuôi cấy. Qua thí nghiệm xác định số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí sau 24h, số lượng tế bào vi
khuẩn trong 1ml dịch là 5,23 107 tế bào.
Bàn luận:
- Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy sau 24h nuôi cấy số lượng tế bào vi khuẩn B.
subtilis natto có sự thay đổi: Số lượng tế bào cố định trong 1g hạt gel sau khi nuôi
cấy 24h đạt giá trị 4,47 1010 tế bào (giảm ít so với số lượng tế bào trong hạt gel
ban đầu là 4,11 1011 tế bào), chứng tỏ khả năng giữ tế bào của calci alginate 3% là
tốt, đồng thời vi khuẩn B. subtilis natto sau khi được cố định trong hạt gel calci
alginate vẫn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Theo nghiên cứu của Nguyễn
24
3,57 108 – 7,03 108 tế bào [11]; nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền cũng cho thấy
mật độ tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định trên gel calci alginate 3%
khi cố định 100ml dịch nuôi cấy là 4,26 108 cfu/g [7]. Mật độ này nhỏ hơn
khoảng 1000 lần so với mật độ tế bào vi khuẩn B. subtilis natto cố định trên gel
calci alginate 3% (4,11 1011 cfu/g). Điều này được giải thích do kích thước của vi
khuẩn B. subtilis natto (khoảng dưới 1 ) nhỏ hơn nhiều so với vi khuẩn L.
acidophilus (khoảng 5 - 7 ) nên dễ dàng xâm nhập vào các khoảng trống của
mạng lưới gel hơn. Hơn nữa, số lượng và thể tích khoảng trống để nhốt giữ tế bào vi khuẩn là có hạn, khi số lượng tế bào chiếm hết chỗ trong mạng lưới gel của calci alginate 3% số tế bào còn thừa bị đẩy ra ngoài trong quá trình ngâm, rửa hạt. Vì
vậy, tế bào B. subtilis natto nhỏ hơn hiển nhiên sẽ được nhốt giữ với số lượng nhiều
hơn trong mạng lưới gel.
- Khi nuôi cấy hạt cố định ở 370C, 110 vòng/phút sau 24h, dịch nuôi cấy có
chứa tế bào vi khuẩn B. subtilis natto (5,23 107 tế bào/ml) là do:
+ Khi nuôi cấy các hạt cố định thì các tế bào nhỏ bị rơi ra khỏi hạt trong quá trình lắc để nuôi cấy, sau đó các tế bào này trong môi trường canh thang lại tiếp tục sinh trưởng và phát triển trong dịch nuôi cấy.
+ Các tế bào vi khuẩn B. subtilis natto vẫn tiếp tục sinh trưởng và phát triển
trong hạt gel. Các tế bào trên bề mặt hạt gel khi phát triển mạnh sẽ thoát ra khỏi hạt gel vào môi trường dịch nuôi cấy, sau đó tiếp tục sinh trưởng và phát triển trong dịch nuôi cấy.
- Theo nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền, mật độ của tế bào L. acidophilus
trong dịch lên men hạt sau 24h có lắc bình là 1,3 104 cfu/ml [7]. Mật độ này nhỏ
hơn so với mật độ tế bào B. subtilis natto trong dịch lên men ở cùng điều kiện
25
+ Số lượng tế bào vi khuẩn L. acidophilus được cố định trong 1g calci alginate
3% nhỏ hơn so với vi khuẩn B. subtilis natto, nên lượng vi khuẩn bị rơi ra ngoài
môi trường trong quá trình lắc cũng ít hơn.
+ Kích thước tế bào vi khuẩn L. acidophilus lớn hơn tế bào B. subtilis natto
nên cũng khó bị rơi ra ngoài môi trường hơn trong quá trình lắc bình lên men.
Kết luận sơ bộ: Số lượng tế bào B. subtilis natto cố định được trong 1g hạt
gel alginate 3% là 4,11 1011 tế bào. Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh thang
(ở 370C, lắc 110 vòng/phút trong 24h), số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1g hạt
gel đã giảm xuống còn 4,47 1010 tế bào và số lượng tế bào B. subtilis natto trong
1 ml dịch nuôi cấy là 5,23 107 tế bào.
3.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trƣờng canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: trƣờng canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt:
3.2.1. Định tính enzyme protease có trong dịch nuôi cấy hạt alginate cố định B. subtilis natto: subtilis natto:
B. subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài B. subtilis. Protease ngoại bào của loài
B. subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vào cuối pha lũy
thừa, cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử [36]. Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới và kết quả của Đào Thị Mai tiến hành trên cùng giống vi khuẩn, protease
tập trung chủ yếu trong phần dịch nổi hay dịch trong [12]. Vi khuẩn Bacillus
subtilis natto được tìm thấy trong món ăn natto là đậu tương lên men, do đó lựa
chọn sữa đậu nành (sản phẩm từ đậu tương) để bổ sung vào môi trường canh thang để khảo sát khả năng sinh enzyme protease từ môi trường nuôi cấy.
Mục tiêu:
Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease khi nuôi cấy hạt alginate cố định B.
subtilis natto trong dịch nuôi cấy với môi trường canh thang và môi trường chứa
26
Tiến hành: Thí nghiệm dựa trên kết quả của nghiên cứu điều kiện lên men
thu sinh khối B. subtilis natto: tiến hành lên men hạt alginate cố định vi sinh vật với
3 môi trường lên men: canh thang, canh thang - sữa đậu nành và sữa đậu nành 20%; lấy mẫu từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24h, 48h, 72h.
- Nhân giống B. subtilis natto trong môi trường canh thang theo phương pháp
nêu ở mục 2.3.1.
- Tạo hạt và nuôi cấy hạt alginate chứa B. subtilis natto trong 3 môi trường:
canh thang, canh thang - sữa đậu nành và sữa đậu nành 20% theo phương pháp nêu
ở mục 2.3.2, ủ trong máy lắc ở 370C, tốc độ 110 vòng/phút.
- Tại mỗi thời điểm 24h, 48h, 72h; thu lấy phần dịch trong.
- Thử khả năng phân giải casein của dịch nuôi cấy với các môi trường khác