Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo quang tại bƣớc sóng tử ngoại 254nm. Mẫu thử: là các mẫu NTN, pha nƣớc đƣợc pha loãng(nếu cần) trong Methanol có HCl 0,1N sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng từ 0,2 - 0,8;
Tƣơng ứng đấy là các mẫu trắng: nhũ tƣơng không chứa dƣợc chất, pha nƣớc (pha loãng nếu cần).
Mẫu chuẩn là các dung dịch Px chuẩn đƣợc hòa tan và pha loãng trong methanol HCl 0,1N đến nồng độ thích hợp.
Công thức tính
Nồng độ Px trong mẫu thử đƣợc tính theo công thức sau:
Ct = . Cc
Trong đó:
Ct: Nồng độ Px trong mẫu thử (μg/mL); mc: Nồng độ Px trong mẫu chuẩn (μg/mL); At: Độ hấp thụ quang của mẫu thử; Ac: Độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn.
2.3.4. Phương pháp xác định tỷ lệ dược chất được nhũ tương hóa
Nguyên tắc: dựa vào sự chênh lệch tỉ trọng giữa 2 pha, ly tâm để tách riêng
pha nƣớc và pha dầu. Tiến hành
- Bƣớc 1: Hòa tan NaCl đến bão hòa vào NTN để làm tăng tỉ trọng pha nƣớc. - Bƣớc 2: Gia nhiệt tới khoàng 40oC
- Bƣớc 3: Ly tâm NTN đã đƣợc làm bão hòa pha nƣớc ở bƣớc 1, điều kiện ly tâm: 12000 vòng/phút, 8oC, trong 30 phút.
- Bƣớc 4: Hút lấy pha nƣớc (phần dƣới), pha loãng 10 lần bằng methanol HCl rồi định lƣợng Px bằng phƣơng pháp đo quang đã mô tả ở mục 2.3.3.
Công thức tính
Tỷ lệ Px trong pha nƣớc:
a =
. k . 100
Trong đó: a: Tỷ lệ Px trong pha nƣớc (%); An: Độ hấp thụ quang của pha nƣớc; Antn: Độ hấp thụ quang của mẫu NTN; k: Hệ số pha loãng.
Tỷ lệ Px đƣợc nhũ tƣơng hóa (%): b = 100 - a.
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá sơ bộ độ ổn định của nhũ tƣơng nano
Các mẫu nhũ tƣơng sau khi bào chế đƣợc bảo quản tại 3 điều kiện khác nhau. Điều kiện lạnh: trong tủ lạnh, nhiệt độ 2 - 8O
C.
Điều kiện phòng thí nghiệm: trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ 25 - 35OC, độ ẩm tƣơng đối 60-90%.
Điều kiện lão hóa cấp tốc: trong tủ vi khí hậu nhiệt độ 40 ± 2OC, độ ẩm 75 ± 5%.
Sau mỗi khoảng thời gian nhất định, đánh giá mẫu dựa trên các chỉ tiêu: KTTP, PDI, zeta…
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm đƣợc lƣu trữ và tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel, sử dụng phân tích ANOVA và Turkey-test để so sánh sự khác nhau giữa các cặp mẫu trong cùng một dãy thí nghiệm. Kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng piroxicam Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ tử ngoại Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ tử ngoại
Cân chính xác khoảng 25 mg piroxicam hòa tan trong 50 ml methanol 0,01 N acid hydroclorid đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 0,5 mg/ml. Pha loãng dung dịch gốc bằng methanol 0,01 N acid hydroclorid đƣợc các dung dịch chuẩn có nồng độ 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 µg/ml. Định lƣợng các mẫu bằng phƣơng pháp đo quang đã trình bày trong mục 2.3.2.5, ghi lại độ hấp thụ quang. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.1:
Hình 3.1. Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ piroxicam
Kết quả trên hình 3.1 cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Px trong khoảng khảo sát (từ 1-20 µg/ml) với hệ số tƣơng quan R2=0,9990. Nhƣ vậy có thể sử dụng phƣơng pháp đo quang với các điều kiện đã nêu để định lƣợng Px sau khi pha loãng bằng methanol 0,01 N acid hydroclorid tới nồng độ thích hợp.
3.2. Khảo sát bào chế nhũ tƣơng nano không chứa dƣợc chất 3.2.1. Xác định sơ bộ công thức nhũ tƣơng nano 3.2.1. Xác định sơ bộ công thức nhũ tƣơng nano
Tiến hành tham khảo các tài liệu để xây dựng công thức sơ bộ cho NTN Px:
y = 0.0395x - 0.0103 R² = 0.9992 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 5 10 15 20 Độ h ấp th ụ qu an g Nồng độ piroxicam(μg/ml)
Dung môi pha dầu: Qua tham khảo nghiên cứu của Klang và cộng sự [27] , trong những dung môi thân dầu đƣợc khảo sát nhƣ các loại dầu thực vật, các alcol béo, piroxicam có độ tan tốt nhất trong triglycerid mạch trung bình. Do vậy Miglyol 810 đƣợc lựa chọn làm pha dầu để hòa tan piroxicam.
Chất diện hoạt: Lựa chọn CDH dựa vào kiểu NT mong muốn và khả năng gây kích ứng mắt. Trong NTN nên sử dụng các loại chất diện hoạt khác nhau để đạt đƣợc HLB cần thiết (tạo kiểu NT mong muốn) và tăng độ ổn định của hệ. Khả năng gây kích ứng mắt của CDH giảm dần theo thứ tự: CDH cation > CDH anion ≈ CDH lƣỡng cực > CDH không ion hóa [16]. Do đó, chúng tôi lựa chọn các CDH không ion hóa là Span 80 và Tween 80- là những CDH dung hợp tốt với mắt [10].
Chất sát khuẩn: Benzalkonium clorid là chất sát khuẩn đƣợc sử dùng nhiều trong thuốc nhỏ mắt (khoảng 60% các thuốc nhỏ mắt trên thị trƣờng có chất sát khuẩn này). Chất này bền vững trong một khoảng pH rộng nhƣng hiệu quả sát khuẩn giảm khi có pH < 5. Benzalkonium clorid có tính hoạt động bề mặt nên nó vừa có tác dụng sát khuẩn vừa làm tăng tính thấm của giác mạc với dƣợc chất trong thuốc nhỏ mắt, tăng hấp thu dƣợc chất qua giác mạc, tăng thế Zeta, tăng gắn kết với lớp mucin tích điện âm của giác mạc. Nồng độ thƣờng sử dụng là 0,01 - 0,02% [3].
Các thành phần khác: Sử dụng các hệ đệm phosphat, citrat, borat là các hệ đệm quen thuộc với chế phẩm thuốc nhãn khoa, dung hợp tốt với mắt [3].
Glycerin đƣợc sử dụng vai trò điều chỉnh áp suất thẩm thấu, làm tăng độ nhớt, tăng bám dính, tăng thời gian tiếp xúc hệ với giác mạc và ổn định nhũ tƣơng [3]. Nhƣ vậy, các thành phần cơ bản của NTN đƣợc trình bày trong bảng 3.1:
Bảng 3.1. Công thức dự kiến nhũ tương không chứa dược chất (NTN trắng)
Pha dầu Miglyol 810 5 g
Span 80 5 g Pha nƣớc Tween 80 Benzalkonium clorid 0,01 g Glycerin 2,5 g Nƣớc Vđ 100 ml
3.2.2. Khảo sát hệ số cân bằng dầu - nƣớc thích hợp nhũ hóa Miglyol 810
Bào chế nhũ tƣơng theo công thức ghi ở bảng 3.1 với 20% và 50% Miglyol, 5% CDH. Sử dụng Tween 40 và Span 80, tỷ lệ khác nhau để đạt đƣợc các giá trị HLB từ 9 tới 15, phân tán bằng máy siêu âm cầm tay và khuấy từ ở tốc độ 2/6 trong 10 phút. Ghi nhận thời gian tách pha của từng mẫu nhũ tƣơng.
Bảng 3.2 . Thời gian tách pha của các nhũ tƣơng với chất nhũ hóa có giá trị HLB khác nhau (n=2).
HLB Thời gian tách pha
Nhũ tƣơng 50% Miglyol Nhũ tƣơng 20% Miglyol
9 ~10 phút 4 tuần 10 ~15 phút 6 tuần 11 ~20 phút 5 tuần 12 ~20 phút 5 tuần 13 ~20 phút 1 tuần 14 ~10 phút 1 tuần 15 ~5 phút 1 tuần ~: xấp xỉ
Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.2 cho thấy giá trị HLB trong khoảng 10- 12 là thích hợp để nhũ hóa Miglyol vào môi trƣờng nƣớc. Thời gian tách pha của nhũ tƣơng 50% dầu dao động trong khoảng 5 - 20 phút, với cực đại 20 phút tại giá trị HLB 10 - 12. Thời gian tách pha của nhũ tƣơng 20% dầu cũng đạt cực đại tại HLB 10 - 12. Do vậy giá trị HLB 11 đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Ảnh hƣởng của loại chất diện hoạt tới đặc tính của nhũ tƣơng không chứa dƣợc chất chứa dƣợc chất
Bào chế các mẫu nhũ tƣơng theo công thức trình bày trong bảng 3.1, thay đổi các CDH khác nhau (Tween 20; Tween 40; Tween 80; natri laurylsulfat; Lutrol) lƣợng CDH đƣợc tính toán để đảm bảo HLB = 11. Phân tán bằng máy siêu âm cầm tay 10 phút, kết hợp khuấy từ ở mức 2/6.
Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.3 cho thấy, CDH benzalkonium tạo NTN có KTTP và PDI lớn nhất, Bốn CDH còn lại tạo NTN có KTTP, PDI tƣơng
đối bằng nhau (KTTP nhỏ hơn 300 nm và PDI nhỏ hơn 0,160). Trị tuyệt đối thế Zeta các mẫu lớn hơn 30 mV cho là đủ để ngăn chặn sự kết tụ của các tiểu phân.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của loại CDH tới đặc tính của nhũ tƣơng trắng (n =2)
Loại CDH KTTP (nm) PDI Zeta (mV)
Tween 80 278,7 0,155 -47,8
Tween 40 268,9 0,138 -47
Tween 20 280,7 0,145 -40,3
NaLs 220,6 0,155 -35
Benzalkonium KTTP lớn KTTP lớn Dƣơng
Để lựa chọn loại CDH, bào chế các mẫu NTN theo bảng 3.1 sử dụng siêu âm bể và khuấy cơ học, bảo quản các mẫu NTN ở điều kiện nhƣ đã nêu trong 2.3.6.
CDH benzalkonium tạo nhũ tƣơng PDI lớn (lớn hơn 0,5) và PDI các mẫu nhỏ hơn 0,5 nên không trình bày kết quả PDI và của Benzalkonium.
Kết quả trình thể hiện trên hình 3.2; 3.3; 3.4 cho thấy, chín ngày bảo quản, KTTP của tất cả các mẫu NTN đều tăng. Tween 20 tạo NTN có KTTP biến đổi nhiều nhất ở cả 3 điều kiện (gấp 3 lần ban đầu, từ 500 nm đến 1500 nm). Ba CDH còn lại (Lutrol, Tween 80, natri laurylsulfat) cho KTTP tăng gấp 2 lần ban đầu (từ 500 nm - 1000 nm). Tween 40 tạo đƣợc nhũ tƣơng có KTTP nhỏ nhất và ít thay đổi nhất trong 5 loại DCH ở các điều kiện. Do vậy Tween 40 đƣợc lựa chọn làm CDH.
0 500 1000 1500 2000
ngày 0 ngày 3 ngày 6 ngày 9
KT TP (n m ) Tween 80 Tween 40 Tween 20 NaLS Lutrol 0 500 1000 1500 2000
ngày 0 ngày 3 ngày 6 ngày 9
K TTP (n m ) Tween 80 Tween 40 Tween 20 NaLS Lutrol Hình 3.3. Ảnh hƣởng của loại CDH tới KTTP của nhũ tƣơng điều kiện phòng thí nghiệm (n=2) Hình 3.2. Ảnh hƣởng của loại CDH
tới KTTP của nhũ tƣơng ở điều kiện lão hóa cấp tốc (n = 2)
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của các loại CDH tới KTTP của nhũ tƣơng ở điều kiện lạnh (n = 2)
3.2.4. Ảnh hƣởng của của tỷ lệ Miglyol:CDH tới sự hình thành nhũ tƣơng không chứa dƣợc chất không chứa dƣợc chất
Bào chế các mẫu nhũ tƣơng theo bảng 3.1, các chất nhũ hóa có HLB 11, thay đổi tổng lƣợng CDH từ 1-11% (Tween 40).
Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.5 cho thấy: khi cố định Miglyol là 5% với lƣợng CDH là 7%, KTTP và PDI của nhũ tƣơng thu đƣợc là nhỏ nhất (p<0,05). Thêm vào đó, giá trị độ lệch chuẩn của KTTP và PDI của mẫu này cũng nhỏ nhất (p<0,05), chứng tỏ độ lặp lại của thí nghiệm cao. Do vậy tỷ lệ Miglyol:CDH là 5:7 đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của của tỷ lệ Miglyol:CDH tới KTTP và PDI (n=3)
0 500 1000 1500 2000
ngày 0 ngày 3 ngày 6 ngày 9
K TTP (n m ) Tween 80 Tween 40 Tween 20 NaLS 230 291 293.2 79.77 238.5 199.8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 100 200 300 400 1% 3% 5% 7% 9% 11% PDI KTTP (n m) Lƣợng CDH SIZE PDI
3.2.5. Độ ổn định của nhũ tƣơng không chứa dƣợc chất
Bào chế 3 mẫu nhũ tƣơng không chứa dƣợc chất theo công thức trong bảng 3.1. Sử dụng Tween 40 và tỷ lệ Miglyol :CDH = 5:7; sử dụng máy siêu âm cầm tay phối hợp với khuấy từ ở mức 2/6. Bảo quản nhũ tƣơng trong điều kiện phòng thí nghiệm (mục 2.3.6), đánh giá KTTP và PDI của mẫu sau mỗi khoảng thời gian nhất định. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.6 cho thấy nhũ tƣơng trắng tạo ra khá bền vững. KTTP và PDI sau 3 tháng không khác so với mẫu mới bào chế (p<0,05).
Hình 3.6. KTTP và PDI của nhũ tƣơng trắng trong ba tháng bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm (n = 3)
3.3. Ảnh hƣởng của công thức tới đặc tính hóa lý của nhũ tƣơng piroxicam
Sau khi bào chế đƣợc nhũ tƣơng trắng bền vững (không tách lớp sau 3 tháng), chúng tôi tiến hành bào chế NTN piroxicam.
Dƣợc chất: Qua tham khảo nghiên cứu của Klang và cộng sự [27], hàm lƣợng piroxicam sử dụng trong công thức nhỏ mắt là 0,1%.
Bào chế NTN theo công thức ghi trong bảng 3.1, thêm Px và thay Tween 80 bằng Tween 40, tỷ lệ Miglyol:CDH = 5:7, sử dụng máy siêu âm cầm tay phối hợp khuấy từ. Kết quả cho thấy Px không ảnh hƣởng tới KTTP, PDI và thế Zeta (230,2 nm; 0,140;-41 mV). Tuy nhiên, sau 3 ngày bảo quản thấy có hiện tƣợng kết tinh, có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng và trên kính hiển vi vật kính dầu.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 50 100 150 200 250 300 0 1 2 3 4 6 8 10 12 PDI KT TP (n m )
Thời gian (tuần)
KTTP PDI
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, tinh thể Px kết tinh màu vàng dƣới đáy lọ và ở hình 3.8 cho thấy các tinh thể Px hình que, màu vàng xuất hiện cả trong giọt nhũ tƣơng và ngoài pha ngoại.
.
Ly tâm 12000 vòng/phút, tách riêng lớp nhũ tƣơng và tinh thể Px. Đo KTTP ở lớp nhũ tƣơng, KTTP và PDI không khác so với ban đầu mới bào chế (230,2nm; 0,140). Kết quả này cho thấy, hiện tƣợng Px kết tinh không ảnh hƣởng tới độ ổn định vật lý của giọt dầu (kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Yan Li và cộng sự) [53]. Qua tham khảo tài liệu của Yan Li và cộng sự [53], hiện tƣợng dƣợc chất kết tinh có thể đƣợc mô tả trong hình 3.9. Trong nhũ tƣơng, dƣợc chất phân bố trong cả pha dầu và pha nƣớc. Vì nguyên nhân nào đó (có thể là sự thay đổi nhiệt độ) mầm kết tinh dƣợc chất đƣợc hình thành, lớn lên trong 2 pha và kết tụ trong pha nƣớc rồi lắng xuống đáy lọ.
Hình 3.9. Mô tả hiện tƣợng kết tinh dƣợc chất trong nghiên cứu của Yan Li[53]
Hình 3.7. Hình ảnh NTN piroxicam xuất hiện kết tinh sau 3 ngày (ảnh
chụp bằng máy ảnh thƣờng)
Hình 3.8. Tinh thể piroxicam xuất hiện trong nhũ tƣơng nano (ảnh chụp qua kính hiển vi trƣờng sáng)
Theo tham khảo các tài liệu, chúng tôi đặt ra một số giả thuyết và hƣớng giải quyết cho hiện tƣợng kết tinh của Px nhƣ sau:
Bảng 3.4. Nguyên nhân có thể gây ra kết tinh Px và hƣớng khắc phục
STT Nguyên nhân có thể Hƣớng khắc phục
1
Lƣợng CDH thân nƣớc lớn tạo micel,
thuận lợi cho quá trình vận chuyển khối Px từ pha dầu sang pha nƣớc và kết tinh.
Giảm lƣợng CDH thân nƣớc
2
Lƣợng glycerin lớn làm tăng độ hòa tan Px
trong pha nƣớc.
Giảm lƣợng glycerin
3
Loại CDH không phù hợp Thay đổi các CDH thân nƣớc khác nhau.
4
Pha dầu thực tế không đủ để hòa tan Px. Tăng lƣợng Miglyol hoặc CDH thân dầu
3.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần công thức tới hiện tƣợng kết tinh piroxicam
Tiến hành khảo sát sơ bộ các nguyên nhân trong bảng 3.4 cho thấy:
Lƣợng CDH hoặc lƣợng glycerin càng giảm, hiện tƣợng kết tinh xuất hiện càng nhanh do nhũ tƣơng kém bền. Do vậy, giảm lƣợng CDH hay lƣợng glycerin cũng không khắc phục đƣợc hiện tƣợng kết tinh Px.
Sử dụng loại CDH khác nhau hoặc tăng lƣợng Miglyol hoặc tăng lƣợng CDH đều có thể khắc phục đƣợc hiện tƣợng kết tinh Px. Kết quả chi tiết đƣợc trình bày dƣới đây:
Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt tới hiện tượng kết tinh của piroxicam
Bào chế các mẫu NTN theo công thức trong bảng 3.1 (đƣa Px vào pha dầu) sử dụng 2 CDH khác nhau là natri lauryl sulfat và tween 40, tỷ lệ Miglyol: CDH là 5:7. Bảo quản tại 3 điều kiện khác nhau. Theo dõi hiện tƣợng kết tinh của Px.
Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.5 cho thấy, các mẫu bào chế với Tween 40 xuất hiện kết tinh Px chậm hơn so với natri laurylsulfat. Nồng độ micel tới hạn của Tween 40 thấp hơn nhiều so với natri laurylsulfat (0,0067x10-3M và 8,67x10-
3M tƣơng ứng) [38]. Do vậy về lý thuyết nồng độ micel Tween 40 trong dung dịch sẽ cao hơn nhiều so với natri laurylsulfat, thuận lợi cho quá trình vận chuyển khối của Px từ pha dầu sang pha nƣớc và kết tinh. Tuy nhiên, các phân tử Tween 40 trên
bề mặt phân cách pha liên kết chặt chẽ hơn natri laurylsulfat (lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử natri laurylsulfat khiến chúng rời xa nhau hơn), lớp áo hấp phụ tạo ra bởi NaLs lỏng lẻo hơn, thuận lợi cho quá trình chuyển khối (1 phân tử Tween 40