2.4.1. Bố trí thí nghiệm
2.4.1.1. Môi trường nuôi cấy
Chủng vi khuẩn lam M.aeruginosa được nhận từ bộ sưu tập giống của Phòng Thuỷ sinh học môi trường - Viện Công nghệ Môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST). Microcystis aeruginosa được phân lập từ nước phú dưỡng hồ Kẻ Gỗ- Hà Tĩnh và nuôi cấy trong môi trường CB ở điều kiện: nhiệt độ là 25 ± 20C và chiếu sáng huỳnh quang ở chế độ (1000 lux, 14 giờ sáng/8 giờ tối). Môi trường nuôi cấy CB bao gồm các thành phần cơ bản sau: 0,15g/l Ca(NO3)2. 4H2O, 0,1g/l KNO3, 0,04g/l MgSO4, 0,05g/l β - sodium glycerophotphate và 0,0001mg/l Bicine. Trước khi hấp thanh trùng cần điều chỉnh pH = 7,3 bằng dung dịch NaOH 0,1M or HCl 0,1M. Tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu đều sử dụng môi trường nuôi cấy này.
2.4.1.2. Đánh giá độc tính của nano bạc chế tạo được đối với chủng VKL M.aeuginosa KG
Chủng VKL Microcystis aeruginosa KG nuôi cấy trong môi trường CB [4] từ tập đoàn giống của phòng Thủy sinh học môi trường, Viện Công nghệ môi trường được sử dụng để đánh giá độc tính của các vật liệu nano bạc và đồng chế tạo được. Để đánh giá độc tính của vật liệu nano bạc và đồng đến sinh trưởng của chủng VKL M.aeruginosa KG, 5 mL môi trường nuôi cấy có chứa chủng VKL M.aeruginosa KGđược bổ sung vào bình tam giác chứa 150 mL môi trường CB. Dung dịch nano bạc và đồng được bổ sung vào các bình tam giác có chứa sinh khối của VKL M. aeruginosa KGvới các nồng độ [0, 0,001; 0,005, 0,01; 0,05; 0,1 và 1 ppm]. Động thái sinh trưởng của chủng VKL M. aeruginosa KGđược theo dõi ở các ngày T0, T2, T6 và T10 của thí nghiệm. Sinh trưởng của chủng VKL M. aeruginosa KG được đánh giá qua mật độ quang học (OD) ở bước sóng 680 nm sử dụng máy đo quang phổ UV- VIS (Simadzu). Hiệu suất ức chế sinh trưởng của VKL được tính bằng công thức sau (Berger và Schagerl, 2003):
Hiệu suất ức chế sinh trưởng của VKL (%) = [(sinh khối mẫu đối chứng - sinh khối mẫu thí nghiệm)/sinh khối mẫu đối chứng] x 100.
2.4.2. Các phương pháp thực hiện
2.4.2.1. Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Sedgwick- Rafter
Buồng đếm Sedgwick-Rafter có dạng hình chữ nhật, sâu 1 mm, diện tích 1000mm2 và thể tích 1,0 mL (Hình2.1). Buồng đếm này là phù hợp để đếm các cơ thể có kích thước nhỏ (<10 µm) và hiếm gặp vì nó chỉ sử dụng 1mL với mật độ 104 tb/mL.
Để xác định mật độ tế bào đòi hỏi các tế bào phải được tách rời ra hoàn toàn. Trong một số trường hợp, việc sử dụng sóng siêu âm hay dùng enzyme trypsin để phân giải tách chúng ra khỏi các tập đoàn. Ngoài ra việc pha loãng
là cần thiết để có thể đếm trực tiếp các tế bào dưới kính hiển vi quang học. Đối với các loài tảo dạng sợi thì việc đếm số lượng tế bào được thay bằng số lượng sợi. Sau đó, tính trung bình số tế bào của một sợi của 50 sợi có thể cho phép tính được tổng số lượng tế bào. Đối với việc đếm số lượng tế bào nuôi cấy, các tế bào cần được cố định với dung dịch Lugol là phù hợp nhất.
Tính toán kết quả:Kết quả về số lượng tế bào của chủng nuôi cấy được thực hiện theo công thức sau:
C = (DF) (NC)/S
Trong đó: C: số lượng tế bào/mL; DF: hệ số hòa loãng; NC: số tế bào đếm được; S: số ô vuông được đếm.
2.4.2.2. Phương pháp xác định khả năng xử lý VKL Microcystis aeruginosa của nano Bạc bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD)
Mật độ tế bào tảo M.aeruginosa trong môi trường được xác định gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang học tại bước sóng 680 nm trên máy quang phổ. Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sáng hấp thụ tỷ lệ thuận với sinh khối tế bào trong mẫu đem đo (khi mẫu có nồng độ tế bào đậm đắc quá như OD > 1,5 thì cần pha loãng với dịch tảo). Nói một cách khác là trong điều kiện sinh trưởng nhất định thì OD tỷ lệ thuận với mật độ tế bào.
2.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu tài liệu thứ cấp
Thu thập những số liệu có sẵn liên quan đến vật liệu nano bạc và VKL
M.aeruginosa từ các báo cáo, tạp chí khoa học trong và ngoài nước.
2.4.2.4. Xác định đặc trưng của vật liệu nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
Sử dụng phương pháp đo kính hiển vi điện tử truyền qua trên máy JEOL 1010 Nhật bản (TEM) tại Viện vệ sinh dịch tễ trung ương để đánh giá kích thước hạt và sự phân bố của các hạt nano điều chế được trong dung dịch.
Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM sử dụng chùm tia electron năng lượng cao để quan sát các vật thể rất nhỏ. TEM là công cụ đặc biệt quan trọng trong việc nghiên cứu các vật liệu nano.Từ phương pháp TEM có thể xác định hình dạng, kích thước hạt nano bạc.
2.4.2.5. Phương pháp Phổ UV-Vis
Phổ UV - VIS của dung dịch nano bạc do phòng công nghệ thân môi trường điều chế được đo trên máy Shimazu UV - 2450 tại Phòng thủy sinh vật môi trường, Viện công nghệ môi trường.
Hình 2.4. Ảnh UV-Vis của các hạt nano bạc
UV-VIS (Ultraviolet-visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn thấy được.
Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tính trên.Các hạt nano bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta sử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc.