a.Đặc điểm hình thái
Mục đích: Xác định đặc điểm hình thái của chủng nấm men đã phân lập, bao
gồm hình dạng, kích thước khuẩn lạc và tế bào nấm men.
- Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa môi trường phân lập (Yeast extract, D-Glucose, Tetracyline, Agar).
- Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ.
- Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men.
- Làm tiêu bản các chủng nấm men quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính E100, ghi nhận hình dạng và kích thước của tế bào nấm men.
b. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men.
Khả năng lên men Saccharose Mục đích
Xác định khả năng lên men saccharose của các chủng nấm men.
Cách tiến hành
- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men trong môi trường YPD. Ủ lắc ở điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
- Chuẩn bị môi trường saccharose 2% (w/v), hút 9 mL môi trường saccharose cho vào ống nghiệm có chứa chuông Durham. Khủ trùng ống môi trường ở 121C trong 20 phút.
- Chủng 1 mL dung dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa 9 mL môi trường saccharose 2% có chứa sẵn chuông Durham đã khử trùng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Xác định chiều cao cột khí sinh ra trong chuông Durham sau mỗi 12 giờ.
- Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong chuông Durham. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Khả năng lên men maltose Mục đích
Xác định khả năng lên men matlose của các chủng nấm men.
Cách tiến hành
- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men trong môi trường YPD. Ủ lắc ở điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
- Chuẩn bị môi trường maltose 2% (w/v), hút 9 mL môi trường maltose cho vào ống nghiệm có chứa chuông Durham. Khử trùng ống môi trường ở 121C trong 20 phút.
- Chủng 1 mL dung dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa 9 mL môi trường maltose 2% có chứa sẵn chuông Durham đã khử trùng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Xác định chiều cao cột khí sinh ra trong chuông Durham sau mỗi 12 giờ.
- Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong chuông Durham. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Xác định hoạt tính phân giải urea Mục đích
Xác định khả năng sinh enzyme urease của các chủng nấm men.
Phương pháp
- Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào môi trường Chistensen Urea Broth (màu vàng cam) và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 24 – 48 giờ.
- Nấm men có khả năng sinh enzyme urease sẽ phân hủy urea tạo thành NH3 khiến môi trường chuyển sang màu đỏ thẩm.
Cách tiến hành
- Chuẩn bị môi trường Chistensen Urea Broth, chuyển 5 mL môi trường Chistensen Urea Broth vào ống nghiệm, khử trùng ở 115oC trong 10 phút, để nguội.
- Chủng các chủng nấm men phân lập được vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường Chistensen Urea Broth, ủ các ống nghiệm ở 30oC trong 24 – 48 giờ. Ghi nhận kết quả.
- Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu tím hồng. - Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
Xác định khả năng phân giải gelatine Mục đích
Xác định khả năng sinh enzyme gelatinase của các chủng nấm men.
- Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào môi trường có chứa gelatine (dạng lỏng) và ủ ở nhiệt độ 30C trong 48 giờ.
- Làm lạnh ở 4 - 8C trong 6 – 8 giờ.
- Nấm men có khả năng sinh enzyme gelatinase sẽ khiến môi trường không đông đặc lại được (do gelatin bị phân hủy).
Cách tiến hành
- Chuẩn bị môi trường chứa gelatine
- Công thức môi trường chứa gelatine cho 1000 mL môi trường:
Gelatine 120 g
Peptone 5 g
Yeast extract 3 g
pH 6,7 ± 0,2
- Hút 3 mL môi trường chứa gelatine cho vào mỗi ống nghiệm. - Khử trùng các ống môi trường chứa gelatine ở 121oC trong 20 phút.
- Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường gelatine đã được khử trùng, ủ các ống nghiệm ở 30oC trong 48 giờ.
- Sau đó cho vào tủ trữ lạnh ở 4 – 8°C trong 6 – 8 giờ.
- Kết quả dương tính khi môi trường trong ống nghiệm không bị đông đặc lại. - Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.