Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 06/2014 đến 12/2014

Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.

3.1.2 Nguyên liệu

Hoa của cây ăn quả ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.

Các mẫu hoa của cây ăn quả được thu thập từ các tỉnh Cần Thơ, Đồng Tháp, Vĩnh Long, bao gồm 13 mẫu:

- Cần Thơ: hoa vú sữa.

- Đồng Tháp: hoa cóc, hoa nhãn, hoa mận, hoa sa pô chê.

- Vĩnh Long: hoa chuối, hoa đu đủ, hoa dừa, hoa khế, hoa mãng cầu, hoa mận, hoa ổi, hoa xoài.

3.1.3 Thiết bị - dụng cụ và hóa chất a. Thiết bị - dụng cụ a. Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ có sẵn trong phòng thí nghiệm Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm.

Máy đo OD (Hitachi, Nhật), máy lắc ủ Eppendorf (Đức), lò vi sóng (Sanyo, Hàn Quốc), máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111, Đức), tủ cấy vi sinh vật (Pháp), cân điện tử (Sartorius, Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức), bộ micropipette P10, P20, P100, P1000 (Bio-Rad, USA), pH kế (Schott, Đức), máy vortex (Đức)

Các dụng cụ khác: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh (Merck), eppendorf, đèn cồn, que cấy.

b. Hóa chất

 Ethanol 96%, ethanol 70%, nước cất.

 Môi trường:

 Yeast extract 0,5%

 Pepton 0,5%

 Glucose 2%

 Tetracycline 0,1 mg/mL

Môi trường YPG agar

 Yeast extract 0,5%

 Pepton 0,5%

 Glucose 2%

 Agar 2%

 Tetracycline 0,1 mg/mL

Môi trường Chistensen urea broth (1000 mL)

 Urea 20 g  Yeast extract 0,1 g  Na2HPO4 9,5 g  K2HPO4 9,1 g  Phenol red 0,01 g  pH 6,7 ± 0,2

Môi trường chứa Gelatine (1000 mL)

 Peptone 10 g  Beef extract 10 g  NaCl 5 g  Gelatine 10 g  Agar 20 g  pH 7,7±0,2 3.2 Phương pháp

3.2.1Phân lập các chủng nấm men từ hoa của cây ăn quả a. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy a. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường YPG và YPG agar được khử trùng ở 121oC trong 20 phút và được bổ sung tetracycline (0,1 mg/mL) sau khi môi trường được làm nguội đến 65°C

b. Nuôi tăng sinh nấm men

Chuyển 1 mL (hoặc 1 g) mẫu vào 100 ml dung dịch môi trường nuôi tăng sinh YPD trong bình tam giác 250 mL, đậy nắp gòn, ủ lắc với vận tốc 150 rpm ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 24 – 48 giờ. Dùng dung dịch này để tiến hành phân lập nấm men.

c. Cấy phân lập nấm men

Cấy trải:

Chuyển 10 µl dịch nuôi tăng sinh lên bề mặt môi trường YPG agar trong đĩa petri.

Trải đều mẫu trên mặt môi trường bằng que cấy trải vô trùng. Úp ngược đĩa và ủ ở 30oC trong 24 – 48 giờ.

Cấy chuyển:

Chọn các khuẩn lạc nấm men đặc trưng, cấy ria trên môi trường YPG agar mới. Úp ngược đĩa và ủ ở 30oC trong 24 – 48 giờ.

Tiếp tục cấy chuyển đến khi thu được chủng nấm men thuần (nấm men thuần: có khuẩn lạc đồng nhất về màu sắc, kích thước, độ nổi, dạng bìa và hình dạng tế bào đồng nhất khi quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính E100).

Cấy trữ:

Khi nấm men đã thuần, chọn khuẩn lạc rời cấy trữ vào môi trường thạch nghiêng. Trữ lạnh ở 4 – 8°C.

Đồng thời nuôi tăng sinh các chủng nấm men trong môi trường tăng sinh YPD trong 24 giờ. Trữ trong môi trường glycerol, (0,5 ml dịch tăng sinh + 0,5 ml glycerol trong 1 ống eppendoft 2,2 ml), Trữ trong tủ đông.

3.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của nấm men a.Đặc điểm hình thái a.Đặc điểm hình thái

Mục đích: Xác định đặc điểm hình thái của chủng nấm men đã phân lập, bao

gồm hình dạng, kích thước khuẩn lạc và tế bào nấm men.

- Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa môi trường phân lập (Yeast extract, D-Glucose, Tetracyline, Agar).

- Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ.

- Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men.

- Làm tiêu bản các chủng nấm men quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính E100, ghi nhận hình dạng và kích thước của tế bào nấm men.

b. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men.

 Khả năng lên men Saccharose Mục đích

Xác định khả năng lên men saccharose của các chủng nấm men.

Cách tiến hành

- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men trong môi trường YPD. Ủ lắc ở điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

- Chuẩn bị môi trường saccharose 2% (w/v), hút 9 mL môi trường saccharose cho vào ống nghiệm có chứa chuông Durham. Khủ trùng ống môi trường ở 121C trong 20 phút.

- Chủng 1 mL dung dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa 9 mL môi trường saccharose 2% có chứa sẵn chuông Durham đã khử trùng.

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Xác định chiều cao cột khí sinh ra trong chuông Durham sau mỗi 12 giờ.

- Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong chuông Durham. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

 Khả năng lên men maltose Mục đích

Xác định khả năng lên men matlose của các chủng nấm men.

Cách tiến hành

- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men trong môi trường YPD. Ủ lắc ở điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

- Chuẩn bị môi trường maltose 2% (w/v), hút 9 mL môi trường maltose cho vào ống nghiệm có chứa chuông Durham. Khử trùng ống môi trường ở 121C trong 20 phút.

- Chủng 1 mL dung dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa 9 mL môi trường maltose 2% có chứa sẵn chuông Durham đã khử trùng.

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Xác định chiều cao cột khí sinh ra trong chuông Durham sau mỗi 12 giờ.

- Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong chuông Durham. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

 Xác định hoạt tính phân giải urea Mục đích

Xác định khả năng sinh enzyme urease của các chủng nấm men.

Phương pháp

- Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào môi trường Chistensen Urea Broth (màu vàng cam) và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 24 – 48 giờ.

- Nấm men có khả năng sinh enzyme urease sẽ phân hủy urea tạo thành NH3 khiến môi trường chuyển sang màu đỏ thẩm.

Cách tiến hành

- Chuẩn bị môi trường Chistensen Urea Broth, chuyển 5 mL môi trường Chistensen Urea Broth vào ống nghiệm, khử trùng ở 115oC trong 10 phút, để nguội.

- Chủng các chủng nấm men phân lập được vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường Chistensen Urea Broth, ủ các ống nghiệm ở 30oC trong 24 – 48 giờ. Ghi nhận kết quả.

- Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu tím hồng. - Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.

 Xác định khả năng phân giải gelatine Mục đích

Xác định khả năng sinh enzyme gelatinase của các chủng nấm men.

- Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào môi trường có chứa gelatine (dạng lỏng) và ủ ở nhiệt độ 30C trong 48 giờ.

- Làm lạnh ở 4 - 8C trong 6 – 8 giờ.

- Nấm men có khả năng sinh enzyme gelatinase sẽ khiến môi trường không đông đặc lại được (do gelatin bị phân hủy).

Cách tiến hành

- Chuẩn bị môi trường chứa gelatine

- Công thức môi trường chứa gelatine cho 1000 mL môi trường:

Gelatine 120 g

Peptone 5 g

Yeast extract 3 g

pH 6,7 ± 0,2

- Hút 3 mL môi trường chứa gelatine cho vào mỗi ống nghiệm. - Khử trùng các ống môi trường chứa gelatine ở 121oC trong 20 phút.

- Chủng trực tiếp khuẩn lạc nấm men vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường gelatine đã được khử trùng, ủ các ống nghiệm ở 30oC trong 48 giờ.

- Sau đó cho vào tủ trữ lạnh ở 4 – 8°C trong 6 – 8 giờ.

- Kết quả dương tính khi môi trường trong ống nghiệm không bị đông đặc lại. - Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.

3.2.3 Khảo sát sơ bộ hoạt tính lên men của nấm men

Mục đích: Xác định hoạt tính lên men của các chủng nấm men dựa vào lượng

CO2 sinh ra trong quá trình lên men.

Phương pháp

- Tăng sinh các chủng nấm men bằng môi trường YPD trong 24 giờ, sau đó chủng dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa chuông Durham và môi trường glucose 2% và ủ trong 48 giờ.

- Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong chuông Durham.

Cách tiến hành

- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men trong môi trường YPD. Ủ lắc ở điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

- Chuẩn bị môi trường glucose 2% (w/v), hút 9 mL môi trường glucose cho vào ống nghiệm có chứa chuông Durham. Khủ trùng ống môi trường ở 121C trong 20 phút.

- Chủng 1 mL dung dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa 9 mL môi trường glucose 2% có chứa sẵn chuông Durham đã khử trùng.

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Xác định chiều cao cột khí sinh ra trong chuông Durham sau mỗi 6 giờ (bắt đầu từ 12 giờ sau khi chủng nấm men vào môi trường).

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

− Thống kê số liệu theo từng mốc thời gian bởi phương pháp phân tích phương sai 1 nhân tố bằng phần mềm minitab. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men glucose mạnh nhất.

3.2.4 Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men Mục đích Mục đích

Xác định khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men trên môi trường YPG rắn có bổ sung ethanol ở các nồng độ khác nhau

Phương pháp

- Chủng các chủng nấm men lên trên bề mặt môi trường YPG agar có chứa nồng độ ethanol lần lượt là: 0%, 3%, 6%, 9% và 12% (v/v), và ủ trong 24 – 48 giờ. - Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển thành khuẩn lạc của các chủng nấm men.

Cách tiến hành

- Cấy ria các chủng nấm men trên các đĩa petri chứa môi trường YPD agar có bổ sung ethanol theo các nồng độ: 0%, 3%, 6%, 9% và 12%.

- Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ 30C.

- Quan sát và ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc của các chủng nấm men. - Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.

3.2.5 Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men Mục đích Mục đích

- Chủng các chủng nấm men lên trên bề mặt môi trường YPD agar và ủ ở các mốc nhiệt độ khác: 30, 35, 37, 40 và 43C, trong 24 – 48 giờ.

- Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển thành khuẩn lạc của các chủng nấm men.

Cách tiến hành

- Cấy ria các chủng nấm men trên các đĩa petri chứa môi trường YPD agar. - Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ: 30, 35, 37, 40 và 43C trong 24 – 48 giờ. - Quan sát và ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc của các chủng nấm men. - Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.

3.2.6 Thử nghiệm khả năng lên men tạo ethanol của các chủng nấm men

Thông qua các kết quả thí nghiệm thử khả năng chịu ethanol (3.2.4), chịu nhiệt (3.2.5) và thử nghiệm khả năng lên men glucose (3.2.3), tuyển chọn các chủng nấm men có đặc tính tốt nhất tiến hành khảo sát khả năng lên men trong dịch rỉ đường ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.

Mục đích

Xác định khả năng tạo ethanol của các chủng nấm men đã tuyển chọn trên cơ chất rỉ đường ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.

Phương pháp

- Chủng các chủng nấm men được chọn vào môi trường dịch rỉ đường 22o Brix, ủ ở các nhiệt độ 30, 35, 37 và 39°C trong 5 – 7 ngày. Xác định pH, Brix trước và sau khi lên men, chưng cất xác định nồng độ ethanol thu được.

- Chỉ tiêu đánh giá: nồng độ ethanol sau khi lên men.

Phương pháp tiến hành:

- Nuôi tăng sinh các chủng nấm men được chọn trong môi trường tăng sinh YPD (mật số đạt 108 tế bào/mL).

- Chuẩn bị dịch rỉ đường 22Brix, thanh trùng rỉ đường bằng NaHSO3 (liều lượng 146 mg/L) trong 2 giờ (Nguyễn Thành Tâm, 2013). Xác định độ pH của dung dịch rỉ đường.

- Chủng 1 mL dịch tăng sinh vào bình tam giác 250 mL, mỗi bình có chứa 99 mL dung dịch rỉ đường 22oBrix.

- Xác định pH và độ Brix, xác định nồng độ ethanol thu được (quy về 20°C) bằng phương pháp chưng cất.

- Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.

- Dùng phương pháp thống kê phân tích phương sai 1 nhân tố và 2 nhân tố bằng phần mềm thống kê Minitab version 16.2.1 (Minitab Inc, USA) để xử lý số liệu thu được.

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập nấm men từ hoa của cây ăn quả

Từ 13 mẫu hoa thu thập ở các tỉnh vùng Đồng bằng Sông Cửu Long, 30 chủng nấm men đã được phân lập. Nguồn phân lập tương ứng của các chủng nấm men được trình bày trong Bảng 4, trong đó có từ hoa cóc, hoa chuối, hoa đu đủ, hoa dừa, hoa khế, hoa mãng cầu, hoa mận, hoa ổi, hoa sa pô chê, hoa vú sữa, hoa xoài, mỗi loại có 2 chủng. Mẫu hoa nhãn phân lập được 4 chủng nấm men và hoa thanh long được 3 chủng nấm men.

Bảng 4. Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu và ký hiệu các chủng nấm men phân lập

STT Chủng nấm men Tên mẫu - Địa điểm thu mẫu

1 CĐ1 Hoa cóc – Đồng Tháp 2 CĐ2 Hoa cóc – Đồng Tháp 3 CH Hoa chuối – Vĩnh Long 4 CH1 Hoa chuối – Vĩnh Long 5 CHĐ Hoa chuối – Đồng Tháp 6 DDV Hoa đu đủ – Vĩnh Long 7 DDV1 Hoa đu đủ – Vĩnh Long 8 DV1 Hoa dừa – Vĩnh Long 9 DV2 Hoa dừa – Vĩnh Long 10 KV1 Hoa khế – Vĩnh Long 11 KV2 Hoa khế – Vĩnh Long 12 MCV1 Hoa Mãng cầu – Vĩnh Long 13 MCV2 Hoa Mãng cầu – Vĩnh Long 14 MĐ2 Hoa mận – Đồng Tháp 15 MĐ3 Hoa mận – Đồng Tháp 16 NĐ1 Hoa nhãn – Đồng Tháp 17 NĐ2 Hoa nhãn – Đồng Tháp 18 NV1 Hoa nhãn – Vĩnh Long 19 NV2 Hoa nhãn – Vĩnh Long 20 OV2 Hoa ổi – Vĩnh Long 21 OV3 Hoa ổi – Vĩnh Long

22 SĐ1 Hoa sa-pô-chê – Đồng Tháp 23 SĐ2 Hoa sa-pô-chê – Đồng Tháp 24 TV1 Hoa thanh long – Vĩnh Long 25 TV2 Hoa thanh long – Vĩnh Long 26 TV3 Hoa thanh long – Vĩnh Long 27 VS Hoa vú sữa – Cần Thơ 28 VS1 Hoa vú sữa – Cần Thơ 29 XV1 Hoa xoài – Vĩnh Long 30 XV2 Hoa xoài – Vĩnh Long

4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của nấm men 4.2.1 Đặc điểm hình thái 4.2.1 Đặc điểm hình thái

Phần lớn các chủng nấm men phân lập được có dạng tế bào hình oval và elip, một số ít có hình cầu, hình que. Khuẩn lạc chủ yếu là dạng tròn, bìa nguyên và độ nổi mô. Kích thước khuẩn lạc dao động từ 1,0 – 3,0 mm sau 2 ngày ủ ở 30C trên môi trường YPD agar (Bảng 5)

Bảng 5. Đặc điểm hình thái nấm men phân lập từ hoa của các loại cây ăn quả

Tên Mẫu Chủng nấm men Hình tế bào nấm men dưới kính hiển vi E100 Hình khuẩn lạc nấm men trên môi

trường YPD agar

Đặc điểm hình thái (sau 48 giờ ủ ở 30°C) Hoa Cóc CĐ1 Khuẩn lạc: trắng đục, tròn nhỏ, 2 – 3 mm Độ nổi: mô Bìa: nguyên Tế bào: hình elip CĐ2 Khuẩn lạc: trắng đục, tròn nhỏ, 2 – 3 mm Độ nổi: mô Bìa: răng cưa Tế bào: hình elip Hoa Chuối CH Khuẩn lạc: trắng đục, tròn nhỏ, 1 – 2 mm Độ nổi: mô Bìa: nguyên Tế bào: hình oval CH1 Khuẩn lạc: trắng đục, tròn nhỏ, 1 – 2 mm Độ nổi: mô Bìa: nguyên Tế bào: hình elip CHĐ Khuẩn lạc: trắng đục, tròn nhỏ, 2 – 3 mm Độ nổi: mô Bìa: nguyên Tế bào: hình elip

Hoa Đu Đủ DDV Khuẩn lạc: trắng đục, tròn nhỏ, 2 – 3 mm Độ nổi: mô Bìa: nguyên Tế bào: hình elip DDV1 Khuẩn lạc: tròn không đều, trơn láng, trắng đục, 1,5 – 2 mm