a. Thu và bảo quản mẫu nước
Mẫu nước được thu tại thời điểm trước khi phun thuốc và 1 giờ, 1 ngày, 3 ngày, 7 ngày và 14 ngày sau khi phun thuốc. Thu mẫu nước xung quanh mỗi lồng (2 chai/lồng). Sau đĩ cho axit HCl lỗng từ từ vào mẫu đến khi pH về đến 3,5-4 và trữ mẫu trong nước đá, sau đĩ chuyển về trữ đơng (-40C) để trữ mẫu.
Hình 3.9 Cối nghiền mẫu não
b. Ly trích mẫu
Lọc mẫu nước qua giấy lọc (cellulose acetate filter) cĩ lỗ lọc 0,45 m để loại bỏ chất rắn lơ lửng. Sau khi lọc xong, phải làm muối hĩa các mẫu 15% NaCl. Sau đĩ hoạt hĩa cột lọc superclean LC-18 SPE bằng 2 mL Methanon và 2 ml nước cất. Sau khi hoạt hĩa cột lọc, cho mẫu qua cột lọc để giữ lại Iprobenfos. Sau khi chạy mẫu qua cột, cần phải làm khơ cột bằng cách để yên trong bơm chân khơng trong vịng 30 – 40 phút. Bước tiếp theo là rửa giải cột lọc bằng 5 mL Aceton và thêm toluen để làm chất giữ tốt trên nền dung mơi để khi cơ quay các chất cần phân tích khơng theo dung mơi ra ngồi. Sau đĩ đuổi khí dung mơi rửa giải bằng cách thổi khí nitơ đến khi cịn lại 300 – 400 L thì dừng và chuyển sang vial và thêm toluen đến vạch 1 mL. Đem đi phân tích Iprobenfos tồn dư trong nước bằng máy GCMS – QP 2010.
+ 15 %NaCl 2 mL Methenol 2 mL nước cất Hút chân khơng Hút chân khơng trong 30 phút 5 mL Aceton Toluen làm chất giữ
Toluen nâng lên 1mL
Hình 3.9 Sơ đồ ly trích mẫu nước tồn dư Iprobenfos
c. Nguyên lý hoạt động máy GCMS
Phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống GC – MS QP 2010 trang bị 1 mẫu tự động AOC-20i Shimadzu và cột mao quản Silica DB-5ms (30 m x 0,25 mm id., độ dày 0,25 m, from J&W scientific, Folsom, CA, USA). Chương trình nhiệt trong quá trình phân tích được thiết lập như sau: 2 phút đầu ổn nhiệt ở 700C và sau đĩ nhiệt độ tăng lên 1500C với tốc độ 180C/phút và giữ trong 1 phút, sau đĩ tăng đến 2000C với tốc độ 30C/phút và cuối cùng tăng đến 2800C với tốc độ
Mẫu nước được giữ ở pH 3,5 – 4 bằng HCl
Lọc mẫu bằng giấy lọc với lỗ lọc 0,45 m
Hoạt hĩa cột lọc superclean LC-18 SPE
Cho mẫu vào cột superclean LC-18 SPE
Làm khơ cột superclean LC-18 SPE
Rửa giải cột cột superclean LC-18 SPE
Bay hơi mẫu
Cho vào Vial
80C/phút và được giữ trong 15 phút. Khí mang sử dụng là Helium với tốc độ dịng là 1 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu là 1 L. Sau khi phân tích định tính, ba mảnh ion được cài đặt để theo dõi cho hợp chất là 204, 123 và 288. Thời gian lưu cho hoạt chất Iprobenfos trong thí nghiệm này được xác định ở phút thứ 20,15 sau khi tiêm mẫu. 3.3.5 Tính và xử lý kết quả - Tính hoạt tính ChE và tỷ lệ ức chế Hoạt tính: HT= s v v v xP ExLxS xH AxC Trong đĩ: HT (hoạt tính): M/g/phút
A: Abs mẫu – Abs blank (Abs/phút)
Cv: thể tích cuvest hay tổng thể tích dung dịch đo (mL) = 3 mL
Hv: thể tích buffer sử dụng để nghiền mẫu
E: hệ số =13,6
L: chiều dài cuvet (cm) =1 cm
Sv: thể tích mẫu sau ly tâm lấy đo (mL) = 0,2 mL
Ps: trọng lượng mẫu lấy nghiền (gam)
Tỷ lệ ức chế TLUC =100 – 100 ChEtbdc ChEs Trong đĩ TLUC: tỉ lệ ức ChE bị ức chế (%)
ChEs: là hoạt tính ChE đo được từng mẫu (M/g/phút)
ChEtbdc: là hoạt tính ChE trung bình của nghiệm thức đối chứng ở từng thời điểm (M/g/phút)
- Xử lý số liệu
Số liệu được tính bằng phần mềm SPSS 20. Số liệu về hoạt tính ChE và nồng độ Iprobenfos được kiểm tra dạng phân phối chuẩn trước khi xử lý thống kê. Số liệu ChE và nồng độ Iprobenfos sẽ được phân tích phương sai (one – way ANOVA) và dùng kiểm định Dunnett để so sánh đối chứng, kiểm định Duncan để so sánh diễn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
biến theo thời gian và Independent samples T-test để kiểm gia giữa ruộng và mương bao.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Nhiệt độ, pH, DO và mực nước trong thời gian thí nghiệm 4.1.1 Biến động nhiệt độ (t0) 4.1.1 Biến động nhiệt độ (t0)
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến đến sinh trưởng và phát triển của sinh vật. Kết quả đo đạc cho thấy nhiệt độ ở ruộng đối chứng dao động từ 28,5 - 29,80C vào buổi sáng (7-8 giờ) và 30,3 - 320C vào buổi chiều (14-15 giờ). Nhiệt độ thấp nhất là 28,50C và cao nhất là 320C, chênh lệch nhiệt độ là 3,50C (Bảng 4.1). Ở ruộng thí nghiệm nhiệt độ thấp nhất là 28 0 C vào buổi sáng và cao nhất là 31,90C vào buổi chiều, khoảng chênh lệch là 3,90C. Vào buổi sáng nhiệt độ dao động từ 280C – 29,30C và buổi chiều là 30,3 0C – 31,9 0C. Ở mương bao nhiệt độ thấp nhất là 27,80C và cao nhất 31,10C, chênh lệch là 3,30C. Nhiệt độ ở mương bao dao động từ 27,8 – 290C vào buổi sáng và 30,8 – 31,10C vào buổi chiều. Như vậy, nhiệt độ buổi sáng thấp hơn nhiệt độ buổi chiều nhưng chênh lệch khơng quá 30C trong cùng một ngày thí nghiệm. Nhìn chung, trong suốt quá trình thí nghiệm nhiệt độ dao động trong khoảng 28,5 0C đến 32,0 0C, là khoảng nhiệt độ phổ biến trong ruộng lúa ở ĐBSCL và thích hợp cho cá (Vromant et al.,
2001). Nhiệt độ buổi sáng và chiều khá đồng nhất giữa các nghiệm thức nên nhiệt độ tác động đều lên các nghiệm thức.
Bảng 4.1 Nhiệt độ nước trong quá trình thí nghiệm
(Số liệu được trình bày Trung bình ±SE, n=3)
Nhiệt độ thích hợp nhất cho Cá Chép là 22-30 0C (Nguyễn Văn Hảo và Ngơ Sĩ Vân, 2001) nên nhiệt độ ở các ruộng thích hợp cho cá Chép sinh sống. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng cá Chép sẽ tăng cường trao đổi chất (Lermen et al., 2004; Quin et al.,1997). Sự gia tăng này làm tăng sự xâm nhập độc chất vào cơ thể (Murty, 1998). Theo nghiên cứu của Ngơ Tố Linh và Nguyễn Văn Cơng (2009),
Thời gian
Đối chứng Ruộng Mương bao
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
Ngày đầu 29,2±0,09 31,1±0,06 29,2±0,17 31,5±0,29 29,0±0,06 31,0±0,09 Ngày 1 29,5±0,06 31,1±0,13 29,1±0,07 30,9±0,07 29,2±0,09 31,0±0,03 Ngày 3 29,4±0,06 31,2±0,15 29,1±0,12 31,9±0,03 29,1±0,13 30,8±0,15 Ngày 5 29,8±0,17 32,0±0,06 29,3± 0,17 31,2±0,14 29,8±0,17 31,0±0,09 Ngày 7 28,5±0,06 30,3± 0,17 28,0±0,09 30,3±0,33 28,2±0,17 30,8 ± 0,17 Ngày 14 29,0±0,12 30,6±0,42 28,8± 0,17 31,2±0,44 27,8±0,17 31,1±0,21
cho rằng tỉ lệ ức chế ChE của cá Rơ đồng ở 300C khi cá tiếp xúc với gốc lân hữu cơ (Diazinon) tăng 1,5 lần so với 200C . Khi nhiệt độ tăng từ 240C lên 300C và 340C trong điều kiện cĩ Diazinon thì ChE của cá Lĩc ở 300C và 340C giảm 2 và 2,7 lần so với 240C (Nguyễn Văn Cơng và Nguyễn Thanh Phương, 2011) nên nhiệt độ cĩ khả năng làm tăng tính độc của Iprobenfos cho cá Chép. Nhiệt độ thay đổi trong ngày phụ thuộc chủ yếu vào năng lượng mặt trời. Cường độ chiếu sáng của mặt trời vào buổi sáng thấp hơn buổi trưa nên nhiệt độ nước thấp vào buổi sáng và cao vào buổi chiều nhưng khơng chênh lệch đáng kể (dao động trong khoảng 30C).
4.1.2 Biến động oxy hịa tan (DO)
DO ở nghiệm thức đối chứng vào buổi sáng (7-8 giờ) dao động từ 0,83±0,08- 1,40±0,09 mg/L và vào buổi chiều là 1,39±0,08-2,2±0,15mg/L, DO thấp nhất là 0,83 mg/L và cao nhất là 2,2 mg/L, chênh lêch khoảng 1,37 mg/L. Ở ruộng thí nghiệm, DO trên ruộng vào buổi sáng dao động từ 0,82±0,05-1,30±0,09 mg/L và buổi chiều dao động từ 1,20±0,29-2,20±0,14 mg/L. DO thấp nhất là 0,82 mg/L và cao nhất là 2,2 mg/L, chênh lệch khoảng 1,38 mg/L. Ở mương bao, DO thấp nhất là 1,10 mg/L và cao nhất là 2,66 mg/L, chênh lệch là 1,56 mg/L. Vào buổi sáng DO dao động từ 1,10±0,10-1,30±0,08 mg/L và buổi chiều là 1,68±0,08-2,66±0,14 mg/L (Bảng 4.2). Nhìn chung DO biến động giữa buổi sáng và buổi chiều cũng như giữa các ngày trong cùng nghiệm thức. DO khá đồng nhất giữa ruộng với đối chứng, DO ở mương bao cao hơn DO ở ruộng và đối chứng.
Bảng 4.2 Hàm lượng oxy hịa tan trong thời gian thí nghiệm
(Số liệu được trình bày Trung bình ±SE, n=3)
Sự biến động DO trong ngày trên ruộng cĩ liên quan đến cường độ chiếu sáng và phụ thuộc trực tiếp vào cường độ quang hợp và hơ hấp của thủy sinh vật. Đối với thủy vực nước động, DO chủ yếu được cung cấp bởi sự khuếch tán là chính; đối với thủy vực nước tĩnh, DO được lấy từ quá trình quang hợp của thực vật
Thời gian Đối chứng Ruộng Mương bao
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
Ngày đầu 0,94±0,10 1,47±0,13 1,10±0,06 2,20±0,14 1,20±0,03 2,66±0,14 Ngày 1 1,40±0,09 1,54±0,11 1,20±0,22 1,53±0,12 1,20±0,10 1,68±0,08 Ngày 3 1,20±0,12 1,54±0,12 1,10±0,15 1,84±0,17 1,20±0,14 2,20±0,07 Ngày 5 0,94±0,10 2,20±0,15 1,30±0,09 2,30±0,28 1,20±0,16 2,70±0,14 Ngày 7 0,83±0,08 1,39±0,08 0,82±0,05 1,46±0,19 1,10±0,10 2,09±0,34 Ngày 14 0,96±0,06 1,70±0,10 0,91±0,05 1,20±0,29 1,30±0,08 2,46±0,20
thủy sinh (Nguyễn Văn Bé, 1995). Trong thí nghiệm này, DO buổi sáng thấp hơn DO vào buổi chiều. Theo Phạm Hữu Nghị và Nguyễn Văn Cơng (2013) nghiên cứu ảnh hưởng của phối trộn thuốc trừ sâu hoạt chất Chlorpyrifos và Fenobucard cho lúa đến cholinesterase cá Rơ nhận thấy DO ở ruộng rất thấp, trung bình 0,7 mg/L vào buổi sáng và 1,9 mg/L vào buổi chiều. Đào Trọng Ngữ và Nguyễn Văn Cơng (2013) cũng cĩ kết quả tương tự DO rất thấp khi nghiên cứu ảnh hưởng của Chlorpyrifos đến ChE cá Lĩc trong ruộng lúa, trung bình 0,8 mg/L vào buổi sáng và 2,9 mg/L vào buổi chiều. Nguyên nhân DO thấp vào buổi sáng là do ban đêm thì quá trình hơ hấp của tất cả sinh vật xảy ra, đồng thời DO được đo vào lúc (7-8 giờ), cường độ quang hợp của lúa chưa mạnh nên hàm lượng oxy hịa tan rất thấp vào buổi sáng. Vào ban ngày, lượng DO trên ruộng được cung cấp chủ yếu là do quang hợp lúa và của phiêu sinh thực vật, nên DO vào buổi chiều luơn cao hơn DO buổi sáng. DO trên mương bao cao hơn DO trên ruộng. Nguyên nhân là do thí nghiệm được triển khai khi lúa đã hơn 40 ngày tuổi, mật độ sạ 30kg/1000m2, hệ số che phủ cao nên khả năng DO khuếch tán vào nước thấp. Ngược lại trên mương bao mặt thống cao, khơng bị che phủ bởi lúa và thực vật nổi nên khuếch tán oxy vào nước cao hơn. Đồng thời nhận được lượng ánh sáng lớn hơn trên ruộng, nên tăng cường khả năng quang hợp của phiêu sinh thực vật.
DO rất thấp ở tất cả các ngày thí nghiệm, thấp hơn rất nhiều so với ngưỡng cho phép thấp nhất là 5mg/L (TCVN 6774:2000) cho các lồi thủy sinh vật. Theo Nguyễn Thúy Liễu và ctv. (2012) khi mơi trường cĩ oxy hịa tan thấp sẽ ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của cá Chép. Sự biến động DO sẽ làm gia tăng độc tính của thuốc trừ sâu đến cá (Bear et al., 2002). Thêm vào đĩ, trong điều kiện bình thường, DO khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính ChE (Cong et al., 2006 trích dẫn Vương Thị Quý, 2009) nhưng khi giảm DO từ 6 - 9 mg/L xuống cịn 1,7 – 2,6 mg/L kết hợp với nhiệt độ tăng từ 20 – 300C thì giá trị LC50-96 giờ của thuốc profenofos lên cá Pimephales promelas giảm từ 333 mg/L xuống 21,5 mg/L (Bear et al., 2002). Theo Hoy et al., (1991) đã nghiên cứu ở lồi cá hồi Bắc Mỹ Oncorhynchus mykiss
được kết quả như sau: Trong điều kiện thiếu oxy hịa tan (DO) một cách trầm trọng sẽ làm gia tăng độc tính của lân hữu cơ dichlorvos và tăng sự ức chế AChE. Khi DO giảm thấp thì hầu hết sinh vật sẽ gia tăng lấy oxy cho nhu cầu cơ thể. Sự gia tăng được thực hiện thơng qua trao đổi nước qua mang, tăng hoạt động hơ hấp khí trời, tăng lượng hồng cầu, tăng ái lực hay khả năng gắn kết oxy với hồng cầu (Jensen et al., 1993). Quá trình này làm cho độc chất xâm nhập vào cơ thể nhiều hơn và nhanh hơn (Hoy et al.,1991). Cá Chép là lồi cá khơng cĩ cơ quan hơ hấp khí trời giống như cá Rơ và cá Lĩc nên cĩ thể Iprobenfos sẽ xâm nhập vào cá Chép nhanh hơn các lồi cá cĩ cơ quan hơ hấp khí trời. Tuy nhiên, cá Chép cĩ thể sống trong mơi trường cĩ hàm lượng oxy hào tan thấp (0,3 – 0,5 mg/L) (FAO,2014). Do vậy cá Chép cĩ
thể tồn tại được ở DO thấp nhưng cĩ thể DO thấp sẽ làm tăng tính độc của Iprobenfos đối với cá Chép.
4.1.3 Biến động pH
Qua kết quả đo đạc cho thấy pH ở ruộng đối chứng dao động từ 6,08 - 6,31 vào buổi sáng và 6,24 - 6,39 vào buổi chiều. pH thấp nhất là 6,08 và cao nhất là 6,39. Chênh lệch giữa giá trị pH thấp nhất và cao nhất 0,31 đơn vị và khơng cĩ sự khác biệt lớn giữa các ngày đo đạc cũng như giữa các vị trí đo đạc. Ở trên ruộng pH thấp nhất là 6,15 và cao nhất là 6,42, chênh lệch khoảng 0,27 đơn vị. Vào buổi sáng pH dao động từ 6,15±0,04-6,37±0,14 và vào buổi chiều dao động từ 6,14±0,06-6,42±0,05. pH ở mương bao dao động từ 6,18±0,12-6,37±0,13 vào buổi sáng và 6,20± 0,07-6,45±0,05 vào buổi chiều, pH thấp nhất là 6,18 và cao nhất là 6,45 chênh lệch khoảng 0,27 đơn vị (Bảng 4.3).
Bảng 4.3 pH nước trong quá trình thí nghiệm
Thời gian Đối chứng Ruộng Mương bao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
Ngày đầu 6,31±0,04 6,39±0,06 6,33±0,08 6,42±0,05 6,37±0,13 6,45±0,05 Ngày 1 6,14±0,07 6,38±0,11 6,37±0,14 6,29±0,03 6,35±0,16 6,23±0,07 Ngày 3 6,24±0,11 6,34±0,06 6,18±0,06 6,14±0,06 6,22±0,07 6,25±0,07 Ngày 5 6,08±0,04 6,25±0,07 6,20±0,06 6,17±0,09 6,18±0,12 6,20±0,07 Ngày 7 6,20±0,06 6,24±0,02 6,20±0,02 6,25±0,02 6,20±0,02 6,42±0,15 Ngày 14 6,11±0,04 6,36±0,07 6,15±0,04 6,41±0,03 6,20±0,08 6,29±0,04
(Số liệu được trình bày Trung bình ±SE, n=3)
Nhìn chung pH luơn ổn định ở các điểm đo đạc và dao động rất ít qua các ngày. pH của mơi trường nước nằm trong khoảng pH thích hợp cho cá Chép là 6,0- 8,5 (FAO, 2014). Đồng thời đa phần độc tính của hĩa chất giảm khi pH tăng (Murty, 1998). Độc tính của pentachlorophenol (PCP) đối với cá giảm khi pH tăng từ 6,5 đến 7,5 (Goodnight, 1942 trích dẫn của Vương Thị Quý, 2009). Sự thay đổi pH ít ảnh hưởng đến độc chất của parathion hơn nhiệt độ (Lydy et al., 1990). Mayer and Ellersieck (1986) cũng xác định pH cĩ ảnh hưởng khơng đáng kể đối với độc cấp tính của parathion cũng như thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ nên pH trong thí nghiệm này thích hợp cho cá Chép sinh sống.
4.1.3 Biến động mực nước.
Ở ruộng đối chứng, mực nước vào buổi sáng dao động từ 11,1±1,10-
nước ở mặt ruộng thấp nhất là 10,4±0,64 cm và cao nhất là 23,4±2,04 cm, chênh lệch khoảng 13 cm. Ở mương bao, mực nước thấp nhất 40,3±4,21 cm và cao nhất là
52,2±1,31 cm, chênh lệch khoảng 11,9 cm (Bảng 4.4). Như vậy mực nước ở ruộng đối chứng ổn định hơn ruộng phun Iprobenfos. Mực nước trên ruộng và mương bao cĩ sự biến động lớn giữa các ngày, biến động lớn nhất là vào ngày 5 sau khi phun.
Bảng 4.4 Mực nước trong quá trình thí nghiệm
Thời gian Đối chứng Ruộng Mương bao
Trước khi phun 12,2±1,05 10,4±0,64 40,3±4,21
Ngày đầu 11,1±1,10 12,1±0,31 43,3±2,4
Ngày 3 13,0±1,00 11,4±1,06 43,2±4,11
Ngày 5 11,4±0,98 23,4±2,04 52,2±1,31
Ngày 7 13,7±0,46 11,4±1,61 40,4±1,54
Ngày 14 13,3±0,23 11,4±0,96 43±0,79
(Số liệu được trình bày Trung bình ±SE, n=3)
Mực nước ở ruộng đối chứng dao động ít trong suốt thời gian thí nghiệm. Nguyên nhân là do ruộng đối chứng khơng cĩ mương bao và khơng tiếp giáp với kênh dẫn nước, đồng thời cĩ đê bao chắc chắn nên mực nước ổn định. Mực nước biến động chủ yếu do sự bốc hơi nước và mưa (trong các ngày thí nghiệm cĩ mưa nhỏ). Ở ruộng phun Iprobenfos mực nước cĩ sự biến động giữa các ngày. Nguyên nhân trong các ngày thí nghiệm cĩ mưa, đồng thời ruộng thí nghiệm tiếp giáp với kênh nên bị ảnh hưởng bởi thủy chiều. Qua bảng số liệu cho thấy mực nước dâng cao ở ruộng phun Iprobenfos vào ngày thứ 5 của thí nghiệm với mực nước cao hơn 10 cm. Nguyên nhân là do thủy chiều dâng cao làm cho lượng nước xâm nhập vào ruộng lớn kéo theo mực nước trong ruộng dâng cao. Mực nước dao động trên ruộng sẽ ảnh hưởng đến nồng độ Iprobenfos sau khi phun do sự pha lỗng. Sự pha lỗng