Theo Phạm Văn Kim (2000) cho biết trong nhóm xạ khuẩn, bộ Actinomycetales và đặc biệt là họ Streptomycetaceae có liên hệ với nông nghiệp nhất. Hiện nay, chúng ta đã dùng rất nhiều loại thuốc phòng trị bệnh cây là những chất kháng sinh do các xạ khuẩn tiết ra như: aureofungin do
Streptomyces cinnamomens var. tericola, blasticidin – S do S. griseo –
Chromogenes, kasugamycin do S. kasugagiensis và validamycin do S.
hygroscopicus var. limoneus nov. var. Iwasa và ctv…
Đỗ Thu Hà (2004) cho biết 2 chủng Streptomyces QN-29 và ĐN-110 có khả năng diệt nấm gây bệnh thối gốc và lở cổ rễ ở cây cà chua và cây đậu đỗ làm giảm hẳn tỉ lệ mắc bệnh ở cây con, không gây dị ứng ở cây con. Đối với cây cà chua con, chủng QN-29 đã làm giảm từ 50% xuống còn 30% cây bị bệnh, chủng ĐN-110 làm giảm từ 50% xuống 32%. Còn đối với cây đậu đỗ chủng QN-29 làm giảm từ 65% xuống còn 38%, chủng ĐN-110 làm giảm từ 65% xuống còn 40%. Đối với nấm gây bệnh héo rũ mốc đen ở lạc do
Aspergillus niger thì chủng QN-29 đã làm giảm từ 45% xuống còn 25%, chủng ĐN-110 làm giảm từ 45% xuống 28%.
Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Việt Hà (2006) cho biết đã phân lập được 508 chủng xạ khuẩn và chọn ra được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cao nhất là Streptomyces antimycoticus,
Streptomyces diastatochromogenes và Streptomyces hygrocopicus. Bên cạnh đó đã bước đầu ứng dụng 3 loại chế phẩm sản xuất từ 3 chủng xạ khuẩn này trong phòng trừ bệnh mốc trắng ở cà chua do nấm Sclerotium rolfsii, bệnh lở cổ rễ và thối bắp trên bắp cải, bệnh khô vằn trên lúa do Rhizoctonia solani. Cũng theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Hà (2008) đã phân lập được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Trong đó, có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm ở mức độ khác nhau đối với 3 chủng nấm CT-1A, CT-2E và CT- 5X.
Đặng Thị Kim Quyên (2010) cho biết chủng Streptomyces-SOFRI 1 có khả năng đối kháng tốt với nấm Fusharium solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên chanh Volka. Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy chủng Streptomyces- SOFRI 1 có khả năng kiểm soát tốt bệnh do nấm F. solani gây ra và còn có khả năng kích khả năng nẩy mầm và phát triển của cây chanh Volka.
gây ra. Bênh cạnh đó, Đoàn Thị Kiều Tiên (2012) cũng đã ghi nhận được 4 chủng xạ khuẩn là 3, 6, 25 và 79 có khả năng ức chế và kiểm soát bệnh héo rũ trên mè do nấm F. oxysporum.
1.6.2 Các nghiên cứu trên thế giới
Một số chủng xạ khuẩn có tiềm năng để làm tác nhân phòng trừ sinh học hiệu quả và kích thích tăng trưởng thực vật. Trong đó, chi Streptomyces đã được nghiên cứu và ứng dụng để kiểm soát các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc từ đất vì có khả năng tiết ra các chất kháng nấm khác nhau (Shimizu et al., 2009). Xạ khuẩn đối kháng được với một loạt tác nhân gây bệnh cây trồng như
Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium, Fusarium và Macrophomina spp. (Valois et al., 1996).
Theo Valois et al. (1996) ghi nhận tại Trung Quốc đã sử dụng
Streptomyces sp. chủng 5406 để chống lại các mầm bệnh từ đất trên cây bông. Hơn nữa, một số thí nghiệm đã chứng minh rằng các chủng Streptomyces cụ thể có thể giảm đáng kể thiệt hại gây ra bởi Pythium hoặc Phytophthora trên cây họ đậu. Gần đây, một thuốc sinh học diệt nấm có chứa tế bào sống
Streptomyces griseoviridis bảo vệ cây trồng chống lại sự xâm nhiễm của nấm
Fusarium và Alternaria.
Theo kết quả nghiên cứu của Zarandi et al. (2009) có 10 chủng
Streptomyces có thể chống lại bệnh đạo ôn lúa do nấm Mafnaporthe oryzae
gây ra trong điều kiện nhà kính.
Theo kết quả nghiên cứu của Gangwar et al. (2011) với tổng số 40 chủng xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ, thân, lá của ba loại cây Aloe vera, Mentha và ocimum sanctu có khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh quan trọng: Aspergillus niger, A. flavus, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Penicillium digitatum. Fusarium oxysporum, P. pinophilum, Phytophthora dresclea, và Colletotrichum fulcatum.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHƯƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 12/2013 đến tháng 10/2014.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông
nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
2.1.2 Thiết bị và vật liệu dùng trong thí nghiệm
Nguồn vi sinh vật đối kháng: 4 chủng xạ khuẩn NCT.TG3, NCT.TG4,
NCT.TG10, NCT.TG18 có khả năng quản lý bệnh thán thư hại gấc nhận được từ phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. Các chủng xạ khuẩn trên do Hoàng Trọng Nam (2013) phân lập trên môi trường chọn lọc xạ khuẩn (chitin agar) từ những mẫu đất thu thập được tại vườn gấc ở Nhị Bình, Châu Thành, Tiền Giang.
Dụng cụ sử dụng trong phòng thí nghiệm: Gồm micropipette, đĩa
petri, ống nghiệm, bình tam giác ống đông, que cấy, đèn cồn, bông gòn, cồn 700 …
Thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm: Tủ cấy vi sinh (PVP clean
bench, Japan), nồi hấp, cân điện tử…
Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm
Môi trường MS (Mannitol Soyal four medium) (Hobbs et al., 1989) Bột đậu nành 20 g
D – Manitol 20 g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
pH 7
Môi trường ISP – 1 (Shirling and Gottlieb, 1966)
Tryptone 5 g Yeast Extract 3 g
pH 7 – 7,2
Môi trường ISP – 2 (Shurtleff and Averre, 1997) Agar 18g Yeast extract 4 g Malt extract 10 g Glucose 4 g Nước cất 1000 ml pH 7
Môi trường ISP – 3 (Küster, 1959)
Oatmeal 20 g Muối A 1 ml
Agar 20 g
Nước cất 1 lít
pH 7,2
Môi trường ISP – 4 (Küster, 1959)
Tinh bột tan 10 g K2HPO4 2 g MgSO4. 7H2O 2 g NaCl 2 g (NH4)2SO4 4 g CaCO3 4 g Muối A 1 ml Nước cất 1000 ml Agar 18 g pH 7 – 7,2
Môi trường ISP – 5 (Pridham and Lyons Jr, 1961)
L - Asparagin 1 g Glycerol 10 g K2HPO4 1 g Muối A 1 ml Nước cất 1000 ml Agar 20 g pH 7 – 7,4
Môi trường ISP – 6 (Tresner and Danga, 1958)
Peptone 20 g
Yeast extract 1 g Ferric Ammonium Citrate 0,5 g KH2PO4 1 g Na2S2O3 0,08 g
Môi trường ISP - 7 (Shinobu, 1958) (trích dẫn bởi Shirling and Gottlieb, 1966) Glycerol 15 g L – tyrosine 0,5 g L – asparagine 1 g FeSO4 7H2O 0,01 g K2HPO4 0,5 g MgSO4. 7H2O 0,5 g Nacl 0,5 g Muối A 1 ml Agar 20 g Nước cất 1 lít pH 7,2 - 7,4
Dung dịch muối A: FeSO4.7H2O - 0,1 g; ZnSO4.7H2O - 0,15 g; MnCl2.4H2O - 0,1g; Nước cất – 100 ml.
Môi trường Skim milk agar (Jha et al., 2009) Sữa bột gạn béo thanh trùng 70 g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
Môi trường Tributyrin agar (Ertuğrul et al., 2007)
Peptone 5 g Yeast extract 3 g Tributyrin 10 ml Agar 20 g Nước cất 1 lít pH 7
Môi trường tinh bột (Santos et al., 2012): tinh bột tan - 10g; yeast extract – 1g; agar – 15g; NaNO3 - 1.2g; KH2PO4 3g; K2HPO4 – 6g; MgSO4.7H2O - 0.2g; CaCl2.2H2O - 0.05g; MnSO4.7H2O 0.01g; ZnSO4.7H2O - 0.001g; pH =7; Nước cất – 1 lít.
2.2 PHƯƠNG PHÁP
Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong việc kiểm soát bệnh thán thư hại gấc
Mục tiêu: nhằm khảo sát các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý, sinh
hóa của các chủng xạ khuẩn triển vọng có khả năng đối kháng với nấm
2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng
2.2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Xác định Gram âm/Gram dương của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng (Prescott et al., 2002) khuẩn vùng rễ có triển vọng (Prescott et al., 2002)
Mục tiêu: nhằm xác định các chủng xạ khuẩn triển vọng thuộc gram
âm/gram dương. Tiến hành thí nghiệm Thuốc nhuộm: + Dung dịch A: Crystal Violet 0,5g Nước cất 100ml + Dung dich B (lugol):
Iodine 1g
Potassium iodied 2g Nước cất 100ml + Dung dịch C (carbon fuchsin)
Basic fuchsin 1g Absolute ethanol 10ml Phenol 5g
Nước cất 1600ml
Cách thực hiện:
Bước 1: Trãi đều giọt huyền phù xạ khuẩn trên lame, sau đó cố định xạ khuẩn bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Bước 2: Nhỏ dung dịch A lên lame (xạ khuẩn đã cố định) trong thời gian từ 1-2 phút, tiếp theo nhỏ dung dịch B trong 1 phút. Đổ bỏ thuốc thừa và rửa lame bằng cồn 950
cho đến khi nào không còn màu chảy ra nữa, kế tiếp rửa qua nước cất, để khô và nhuộm với dung dịch C trong 15 giây, rửa nước và để khô.
Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 100X, xạ khuẩn Gram âm sẽ có màu đỏ, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím.
2.2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất và sắc tố tan và sắc tố tan
Mục tiêu: Ghi nhận màu sắc các chủng xạ khuẩn trên nhiều loại môi
trường khác nhau.
Tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Shirling
& Gottlieb (1966)
Bước 1: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường: ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, mỗi chủng cấy năm đĩa, để ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Quan sát màu sắc khuẩn ty cơ chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS) và sắc tố tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy sau 7, 14, 21 ngày. Màu sắc của khuẩn ty khí sinh được thể hiện qua các màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám , Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh. (Tresner & Backus, 1963).
Ghi nhận màu sắc của khuẩn ty cơ chất theo Szabó and Marton (1964): quan sát màu sắc khuẩn lạc của xạ khuẩn ở mặt sau đĩa Petri. Ghi nhận các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0) ( trích bởi Shirling & Gottlieb,1966)
Sắc tố hòa tan vào môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím… Nếu có ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0).
2.2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Quan sát cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình dạng bào tử. dạng bào tử.
Mục tiêu: Quan sát và ghi nhận hình dạng cuống sinh bào tử của các
chủng xạ khuẩn triển vọng.
Tiến hành:
Bước 1: Cắt những miếng thạch môi trường MS (1cm x 1cm) đặt lên miếng lam vô trùng. Tiếp theo cấy xạ khuẩn lên miếng thạch môi trường, sau đó đậy lamen lại.
Bước 2: Đặt miếng lame trong đĩa petri đã vô trùng trong điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối, ở nhiệt độ 280C. Tiến hành nuôi cấy mỗi chủng trên năm đĩa petri.
Bước 3: Sau 10 ngày quan sát cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử của xạ khuẩn dưới kính hiển vi điện tử
+ Ghi nhận theo đánh giá của Tresner et al., (1961):
Chuỗi bào tử có các dạng: thẳng hay hơi lượn sóng ký hiệu là RF (Rectif lexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn ốc ký hiệu là S (Spirales).
Hình dạng bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có các dạng: dạng trơn, dạng gai, dạng khối u, dạng có lông.
2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát đặc điểm sinh lý – sinh hóa của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong kiểm soát bệnh thán thư hại gấc khuẩn có triển vọng trong kiểm soát bệnh thán thư hại gấc
2.2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát khả năng tiết enzym ngoại bào (enzyme protease) các chủng xạ khuẩn có triển vọng protease) các chủng xạ khuẩn có triển vọng
Mục tiêu: nhằm xác định khả năng tiết enzym protease của các chủng
xạ khuẩn triển vọng.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5
lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn vùng rễ có triễn vọng.
Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp
của Mitra and Chakrabartty (2005).
Bước 1: Các chủng xạ khuẩn vùng rễ được nhân nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường MS để mặt nghiêng trong 5 ngày.
Bước 2: Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường Skim milk agar.
Chỉ tiêu theo dõi
Tiến hành đo bán kính vòng phân giải protein sau 2, 4, 6, 8 ngày sau thí nghiệm
2.2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát khả năng tiết enzym lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng xạ khuẩn có triển vọng
Mục tiêu thí nghiệm: nhằm xác định khả năng tiết enzym lipase của
các chủng xạ khuẩn triển vọng
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với
5 lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn vùng rễ có triễn vọng.
Tiến hành: Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của
Bước 1: Xạ khuẩn vùng rễ được nhân nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường MS để mặt nghiêng trong 5 ngày.
Bước 2: Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường Tributyrin agar.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo bán kính vòng phân giải lipid sau 2, 4, 6, 8 ngày sau khi cấy.
2.2.2.3 Thí nghiệm 2.3: Khảo sát sự hình thành sắc tố melanin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng chủng xạ khuẩn có triển vọng
Mục tiêu thí nghiệm: nhằm xác định khả năng tiết melanin của các chủng xạ khuẩn triển vọng.
Tiến hành thí nghiệm:
Bước 1: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP6, ISP7 ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Quan sát màu của môi trường sau 2, 4 ngày. Nếu sinh melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ màu xanh nâu sang màu nâu đậm cho đến màu đen (E. t. Shirling & D. Gottlieb, 1966).
2.2.2.4 Thí nghiệm 2.4: Khảo sát khả năng đồng hóa nguồn carbon của các chủng xạ khuẩn có triển vọng chủng xạ khuẩn có triển vọng
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 5 lặp lại.
Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp Shirling and Gottlieb (1966).
Tiến hành thí nghiệm:
Bước 1: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP9 có bổ sung 1% nguồn carbon cellulose, saccharose, mannitol và glucose.
Bước 2: Ghi nhận chỉ tiêu vào thời điểm 7 và 14 NSTN.
- Trong đó môi trường glucose được coi là đối chứng dương (+) và môi trường không có đường được coi là đối chứng âm (-).
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc yếu hơn đối chứng dương một ít: có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu là (+).
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++). - Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không sinh trưởng,
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm nhưng kém hơn đối chứng dương, ký hiệu là (±).
Nội dung 2: Khảo sát các cơ chế liên quan đến khả năng kiểm soát bệnh của các chủng xạ khuẩn có triển vọng
2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải chitin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng khuẩn có triển vọng
Mục tiêu: Đánh giá khả năng tiết và phân giải chitin của các dòng xạ
khuẩn triển vọng trong phòng trừ bệnh thán thư hại gấc.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 5 lần
lặp lại. Mỗi chủng xạ khuẩn là một nghiệm thức.
Tiến hành:
Bước 1 Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: Xạ khẩn được cấy trên môi trường MS trong đĩa Petri trong 5 ngày. Sau đó cho 5 ml nước cất thanh trùng vào đĩa và cạo các bào tử xạ khuẩn tạo thành dung dịch huyền phù xạ khuẩn.
Bước 2: Xạ khuẩn được cấy thành 4 điểm, mỗi điểm là khoanh giấy thấm vô trùng có bán kính 5 mm được tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa Petri chứa môi trường chitin agar (4% colloidal chitin). Các đĩa Petri được đặt trong tủ định ôn để xạ khuẩn phát triển.
Theo dõi và ghi nhận chỉ tiêu: đo bán kính phân giải chitin vào 3, 5, 7
ngày sau khi cấy.
2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phân giải β-glucan của các chủng xạ khuẩn có triển vọng xạ khuẩn có triển vọng
Mục tiêu: Đánh giá khả năng tiết và phân giải β-glucan của các dòng xạ
khuẩn triển vọng trong phòng trừ bệnh thán thư hại gấc.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần
lặp lại
Tiến hành:
Bước 1 Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: xạ khuẩn được cấy trên môi trường