5. Điểm mới của đề tài
3.5.1. Nhân giống Gluconacetobacter BHN2 ĐB trên môi trường
nghiêng.
3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 thu nhận được sau khi xử lý đột biến được cấy truyền để nhân giống trên môi trường thạch nghiêng sau khi vi khuẩn phát triển đem đi bảo quản trong tủ lạnh. Quá trình cấy truyền này được tiến hành liên lục để tạo lượng sinh khối đủ cho quá trình hoạt hóa.Chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB trên thạch nghiêng được thể hiện qua hình 3.12.
Khi cấy trên thạch nghiêng, 3 mẫu đột biến ĐB 3, ĐB 5, ĐB 7 thể hiện đặc tính khác so với chủng Gluconacetobacter BHN2 ban đầu.Vi khuẩn mọc không tạo đường cấy rõ nét, bề mặt lồi ít, trong và mất tính nhớt, dai.
3.5.2. Nuôi chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường hoạt hóa thu sinh khối
Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối lần lượt từ 3 mẫu ĐB 3, ĐB 5, ĐB 7 từ các ống giống sau đó nuôi trong các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 theo tỉ lệ 3 ống giống/250ml dịch.
Tiến hành nuôi lắc các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 trong khoảng 1 - 1,5 ngày để thu sinh khối.
Kết quả khi tiến hành nuôi lắc dịch nhân giống cấp 1 được thể hiện qua hình 3.13.
Hình 3.13.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường hoạt hóa
Sau quá trình nuôi lắc 1 - 1,5 ngày trong các bình chứa dịch nhân giống có màu trắng đục. Khác với chủng Gluconacetobacter BHN2 hình thành hệ sợi lơ lửng, các mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 không có dạng sợi, chỉ vẩn đục.
3.5.3. Tạo màng BC từ 3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7
Tiến hành lên men tạo màng BC từ 3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 trong khoảng 3 - 5 ngày được thể hiện qua hình 3.14.
Hình 3.14.Lên men tạo màng BC từ các mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7
Sau 5 ngày tiến hành lên men tĩnh, trên bề mặt các hộp lên men có hình thành một lớp màng mỏng. Tuy nhiên, bề mặt của lớp màng có độ dày mỏng khác nhau:
ĐB 3 có độ dày màng mỏng nhất, lớp màng mịn, đồng đều.
ĐB 5 có độ dày màng lớn nhất, bề mặt không đồng nhất, rất mủn. ĐB 7 có độ dày trung bình, bề mặt mủn.
Mẫu ĐB3, ĐB5khi thu nhận chỉ là một lớp màng mỏng, bở, nhăn.
Kết quả hình ảnh các mẫu màng thu được từ 3 mẫu đột biến được thể hiện qua hình 3.15 và 3.16.
Hình 3.15.Màng BC từ mẫu ĐB3, ĐB5
Mẫu ĐB7 không có khả năng tạo được lớp màng mỏng mà chỉ có hệ sợi lơ lửng trong dịch lên men hoặc dạng váng mỏng.
Tiến hành nghiên cứu khả năng tạo màng qua 2 đợt đồng thời kiểm tra sự ổn định khả năng tạo màng và tính chất của các chủng đột biến này. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3.Khả năng tạo màng BC của các chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB lần thứ nhất
STT Kí hiệu chủng Thời gian
tạo màng Tính chất màng
1 ĐB3 68 ± 2 giờ Mỏng, dễ rách, nhăn
2 ĐB5 79± 2,5 giờ Mỏng, dễ rách, không đều,
nhăn
3 ĐB7 75 ±1 giờ Không tạo màng, dạng váng
Lên màng lần thứ nhất tôi không thu được 3 mẫu.Ở các hộp lên men với ĐB7 không có khả năng tạo màng, chỉ là lớp váng nổi trên bề mặt dịch lên men hoặc dạng sợi, mủn lơ lửng trong dịch lên men. Ở các hộp lên men với ĐB3, ĐB5, thu được một lớp màng mỏng bao phủ toàn bộ bề mặt hộp lên men. Tuy nhiên lớp màng này đều rất mỏng, nhăn, và mủn, không thể tiến hành thu nhận. Tôi tiến hành lên men lần thứ 2 với các chủng ĐB3, ĐB5, ĐB7.
Bảng 3.4. Khả năng tạo màng BC của các mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 lần thứ hai
STT Kí hiệu chủng Thời gian tạo
màng Tính chất màng
1 ĐB3 62±1,5 giờ Mỏng, nhăn, dễ rách
2 ĐB5 75 ± 2 giờ Rất mỏng, nhăn, không đều, dễ rách
Kiểm tra khả năng tạo màng của 3 mẫu qua 2 lần tiến hành thì không thu được màng BC thành phẩm. Có 3 mẫu ĐB3, ĐB5 tạo được 1 lớp màng mỏng trên bề mặt hộp lên men còn các mẫu ĐB7 không có khả năng tạo được màng.
Giải thích nguyên nhân của chủng sau đột biến mất khả năng tạo màng:
Tia UV đã tác động vào bộ máy di truyền của vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 làm thay đổi đoạn gen mã hóa khả năng tạo màng các chủng BHN2. Do vậy, khi gen mã hóa tạo màng bị thay đổi sẽ dẫn tới mất khả năng tạo màng ở các chủng đột biến.
Do tia UV tác động phá hỏng cấu trúc của enzyme tạo màng.
Do chủng giống Gluconacetobacter BHN2 khi thu nhận nghiên cứu đã bị thoái hóa so với chủng giống ban đầu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Lên men tạo màng BC thành công từ chủng Gluconacetobacter BHN2 thu nhận từ phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
1.2. Xử lý đột biến chủng Gluconacetobacter BHN2 dưới tác nhân vật lý là tia UV ở bước sóng 260nm.
1.3. Xác định được thời gian đột biến thích hợp là 7 phút với khoảng cách 15cm qua thạch đĩa petri.
1.4. Quan sát thấy sự sai khác về hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, đặc tính sinh học cơ bản giữa chủng Gluconacetobacter BHN2 và
Gluconacetobacter BHN2 ĐB.
1.5. Qua đột biến không thu nhận được chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB có khả năng tạo màng tốt hơn chủng Gluconacetobacter BHN2
2. Kiến nghị
Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ nghiên cứu được ảnh hưởng của tia UV tới khả năng sống sót của chủng Gluconacetobacter BHN2 và chỉ gây đột biến lần đầu. Để có kết quả chính xác hơn cần gây đột biến một số lần nữa.
Nên nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng của môi trường tới khả năng tạo màng của các chủng đột biến.
Nên xác định rõ về bản chất của việc đột biến bằng phương pháp phân tử. Nên nghiên cứu và so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đột biến và chủng gốc để có được chỉ tiêu cụ thể về sự biến đổi này.
Kết quả nghiên cứu này là cơ sở để các nghiên cứu tiếp theo lựa chọn phương pháp xử lý phù hợp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Nguyễn Thúy Hương (2006). Chọn lọc dùng Acetobacter xylium thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn. Luận án Tiến sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chi Minh.
[2]. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thành (2006). Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylium sử dụng làm màng trị bỏng, Số 361, Tạp chí Dược học.
[3]. Nguyễn Thị Nguyệt, Đinh Thị Kim Nhung (2005), Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinumcho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da.
Tạp chí Khoa học, số 4, Đại học Sư phạm Hà Nội 2, trang 127-138. [4].Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thùy Vân (2010), Nghiên cứu một số đặc
tính sinh học của vi khẩn Acetobacter xylium phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam. Tạp chí thông tin Y dược - Bộ Y tế, trang 62-65. [5]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011),
Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylium sinh tổng hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng. Tạp chí y học thảm họa và bỏng.Viện bỏng Quốc gia, Hội bỏng Việt Nam, trang 122-127.
[6]. Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm. Luận án PTS khoa học sinh học Đại học Sư phạm Hà Nội.
[7]. Mai Thị Hằng (2011), Sách Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sư phạm.
B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[9].Abbas Rezaee, Sanaz Solimani, Mehdi Forozan demogadam (2005), Role of plasmid in production of Acetobacter xylium biofilms. Vol 1, No3,
American Journal of Biochemistry and Biotechnology ISN 1553-3468. [10]. Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005), Polysaccharides and
polyamides in the food industry, pp. 31-85.
[11]. Alina Krystrynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Plucienniczak (2005),
Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylium, Acta biochimica polonica, Vol. 52, pp. 691 - 698.
[12]. Ben - Hayyim. G, Ohad. I, Ph. D (1965), Synthesis of cellulose by Acetobacter xylium: VIII. On the formation and oriention of bacterial cellulose fibril in the presence of acidic polysaccharides. Vol. 25, The Journal of Cell Biology.
[13]. Bergey. H, John. G. Holt (1992), Bergey’s manual of dereminativa bacteriology.