5. Điểm mới của đề tài
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24h giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha
loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 30oC trong 5 ngày đếm khuẩn lạc (CPU) trong môi trường đĩa Petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [7].
1000 1 10 i n i A x N x V
Trong đó: N: Tổng số CPU trong 1ml mẫu ban đầu
Ai: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải CaCO3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10-n
Vi: Thể tích dịch mẫu trên môi trường đĩa phân lập 10-n: Là độ pha loãng của mẫu phân lập
2.2.1.2. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép).
Tiến hành: Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram:
1. Tím gentian: 1 phút. 2. Rửa nước. 3. Dung dịch Lugol: 1 phút. 4. Rửa nước. 5. Cồn 950: 1 phút. 6. Rửa nước. 7. Dung dịch Fucshin: 1 phút. 8. Rửa nước.
Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng (Gram âm), đó chính là vi khuẩn Gluconacetobacter [2], [4], [5], [7].
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ xác định là
Gluconacetobacter được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 - 4 ngày ở 300C.Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống.Cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng hai tháng một lần [4], [5], [7].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem đi sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [4], [5], [7].
2.2.1.5. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng. Sau đó khử khuẩn ở đèn tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường 5% giống hoạt hóa. Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 3 - 4 ngày [5].