5. Điểm mới của đề tài
3.1.1.Quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 được phân lập từ màng của các nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo phương pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng thí nghiệm Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Hình ảnh vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên kính hiển vi quang học phóng đại 1000 lần được thể hiện trong hình 3.1.
Hình3.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên kính hiển vi quang học phóng đại 1000 lần
3.1.2. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2
Dựa theo kết quả các nghiên cứu của nhóm tác giả PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, TS. Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 được tiến hành theo 4 bước cơ bản như sau:
Bước 1: Nhân giống Bước 2: Hoạt hóa
Bước 3: Lên màng Bước 4: Thu màng Cụ thể như sau:
Bước 1: Nhân giống
Quá trình nhân giống được tiến hành cấy truyền liên tục chủng
Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng.
Hình ảnh vi khuẩn Glucoacetobacter BHN2 được cấy truyền trên thạch nghiêng được thể hiện trong hình 3.2.
Chủng Gluconacetobacter BHN2 khi nuôi cấy trên thạch nghiêng có màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bóng, có tính dai và nhớt.
Bước 2: Hoạt hóa
Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuẩn từ các ống giống
Gluconacetorbacter nuôi trong các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 theo tỉ lệ 3 ống giống/250ml dịch.
Sau đó tiến hành luôn lắc các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 trong khoảng 1 - 1,5 ngày để thu sinh khối Gluconacetobacter.
Các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 được thể hiện trong hình 3.3.
Hình 3.3.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trong môi trường hoạt hóa
Sau 1 - 1,5 ngày nuôi lắc, các bình giống Gluconacetobacter BHN2 có màu trắng đục, có hệ sợi trắng lơ lửng trong dung dịch, đó là các sợi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng.
Bước 3: Tạo màng
Dùng micropipet cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trường lên men theo tỉ lệ 10ml/100ml môi trường.
Tiến hành lên men tĩnh trong 4-5 ngày.
Các hộp lên men sau 4 - 5 ngày thấy xuất hiện 1 lớp màng màu trắng đục trên bề mặt dịch lên men. Lớp màng này có thể dày hay mỏng khác nhau ở các hộp khác nhau.
Bước 4: Thu màng
Tiến hành thu màng ở ngày thứ 5.
Hình 3.4. Màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2
Sau 4 - 5 ngày tiến hành thu màng BC. Chuẩn bị một hộp cồn 900 để ngâm bảo quản màng. Dùng găng tay cao su vướt màng trong các hộp lên men. Tiến hành cân và kiểm tra đặc tính của từng màng như cân nặng, độ dày, độ dai.
3.2. Xử lý đột biến chủng Gluconacetobacter BHN2 dƣới tác dụng của tia UV
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu trước, tôi tiến hành xử lý đột biến chủng
Gluconacetobacter BHN2 bằng tác nhân vật lý là tia UV ở các khoảng thời gian 3, 5, 7, 9 phút.
Chủng Gluconacetobacter BHN2 lấy từ các bình hoạt hóa được trang đều trên môi trường MT1 trong các hộp petri. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để trong tủ ấm 30o
C trong 2 - 3h để các tế bào phân chia.
Tiến hành đột biến bằng cách đặt mẫu cần đột biến cách đèn UV có bước sóng 260nm là 15cm.
Tiến hành xử lý đột biến ở các khoảng thời gian 3, 5, 7, 9 phút qua 3 lần thí nghiệm.
3.2.1. Thí nghiệm lần 1
Tiến hành với 8 hộp petri chứa chủng Gluconacetobacter BHN2. Mỗi lần tiến hành xử lý 2 hộp petri với tia UV ở khoảng cách 15cm. Làm lần lượt với các khoảng thời gian 3, 5, 7, 9 phút.
Sau đó nuôi vi khuẩn ở tủ ấm 30o
C trong 1 - 3 ngày và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc.
Bố trí thí nghiệm xử lý đột biến vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 với tia UV được thể hiện qua hình 3.5.
Ở lần thí nghiệm thứ nhất, khuẩn lạc mọc ở các hộp petri 3, 5, 7 phút.Ở hộp petri 9 phút không có khuẩn lạc nào sống sót.Tuy nhiên mật độ khuẩn lạc ở các hộp petri quá dày, một số hộp bị mốc.Hình thái khuẩn lạc được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến 5 phút sau 3 ngày
Có thể giải thích nguyên nhân khuẩn lạc mọc quá dày ở các hộp petri do tiến hành trang vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ở nồng độ quá cao, kỹ thuật trang chưa đều và còn bị nhiễm mốc.
Chính vì vậy tôi tiến hành lặp lại thí nghiệm lần thứ 2.
3.2.2. Thí nghiệm lần 2
Tiến hành làm thí nghiệm tương tự như lần thứ nhất.
Ở lần thí nghiệm thứ 2, khuẩn lạc cũng mọc ở các hộp petri 3, 5, 7 phút và không mọc ở 9 phút. Điều này tương đương với kết quả thu được ở lần thí nghiệm thứ nhất.
Mật độ khuẩn lạc ở các hộp petri giảm dần ở các khoảng thời gian đột biến lần lượt từ 3, 5, 7 phút.Ở 2 hộp petri đột biến trong 3 phút, mật độ khuẩn lạc dày, mọc rất tốt. Tiếp đến là 5 phút, mật độ khuẩn lạc ít hơn, tuy nhiên khả năng sống sót của vi khuẩn vẫn tốt. Ở khoảng thời gian 7 phút, mật độ khuẩn lạc giảm, khuẩn lạc mọc yếu, khả năng sống sót của vi khuẩn kém.
Tuy nhiên, ở một số hộp petri vẫn bị nhiễm mốc do kỹ thuật làm thí nghiệm chưa tốt. Cụ thể được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến ở 7 phút sau 3 ngày
Tôi tiến hành lặp lại thí nghiệm lần thứ 3 để kiểm chứng kết quả ở lần thứ 1, 2.
3.2.3. Thí nghiệm lần 3
Tiến hành thí nghiệm tương tự như lần 1, 2.Bố trí thí nghiệm như hình 3.8.
Hình 3.8. Xử lý đột biến 3 phút vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
Sau thí nghiệm, ở các hộp petri khi xử lý ở 3, 5, 7 phút khuẩn lạc vẫn mọc với mật độ giảm dần; ở 9 phút, không một khuẩn lạc nào sống sót.Kết quả này tương tự với 2 lần thí nghiệm trên.Ở đây thấy rõ sự thay đổi về mật độ khuẩn lạc. Khuẩn lạc mọc rất tốt ở khoảng 3 phút, mọc khá tốt ở 5 phút, mọc yếu ở 7 phút và hoàn toàn không có khuẩn lạc ở 9 phút. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn
Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến 3 phút sau 3 ngày
Khuẩn lạc mọc tốt và khỏe.Bề mặt khuẩn lạc trơn, bóng, mép có thể phẳng hay xù xì.
Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần.Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian tác động tia UV đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
Thời gian đột biến (phút) Khả năng mọc của vi khuẩn
3 +++ 5 ++ 7 + 9 - Chú thích: +++: Mọc rất tốt (mật độ khuẩn lạc >30CFU/đĩa) ++: Mọc khá (mật độ khuẩn lạc từ 4-10 CFU/đĩa) +: Mọc yếu (mật độ khuẩn lạc từ 1 - 3 CFU/đĩa) -: Không mọc trên 50% số đĩa petri (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy, tại thời điểm 3 phút số lượng khuẩn lạc mọc tốt, tại thời điểm 5 phút, khả năng sống sót của vi khuẩn khá, tại thời điểm 7 phút số lượng khuẩn lạc mọc yếu nhất. Ở thời gian 9 phút, không một tế bào nào của vi khuẩn sống sót, tuy nhiên tác động tia UV dưới 7 phút thì chúng vẫn mọc.
Như vậy, vấn đề đặt ra là cần lựa chọn khoảng thời gian xử lý đột biến tia UV phù hợp.
3.3. Lựa chọn khoảng thời gian xử lý đột biến tia UV phù hợp
Qua bảng số liệu ta thấy, thời gian tác động của tia UV càng dài thì ảnh hưởng càng mạnh tới khả năng sống sót của vi khuẩn. Vậy chứng tỏ tại thời điểm 7 phút chính là ranh giới của sự đột biến và không đột biến nên tôi quyết định chọn chủng đột biến với thời gian đột biết là 7 phút cách đèn tử ngoại 15cm là thích hợp cho quá trình tác động tia UV đối với vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 nhằm thu được dòng đột biến.
Có thể giải thích điều này do sức sống của các tế bào vi khuẩn là khác nhau nên chúng chống chịu khác nhau đối với tia tử ngoại.
Qua quá trình xử lý đột biến, tôi chọn được 3 mẫu ĐB3, ĐB5 và ĐB7 làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy, thời gian 7 phút là ranh giới của sự đột biến và không đột biến, là khoảng thời gian thích hợp cho quá trình tác động tia UV đối với vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2.
3.4. So sánh hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của chủng
Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB
3.4.1. Hình thái khuẩn lạc
Sử dụng phương pháp quan sát để so sánh hình thái khuẩn lạc của chủng Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB, được thể hiện ở hình 3.10.
(A) (B)
Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2(A) và Gluconacetobacter BHN2 ĐB (B)
Khi sinh trưởng trên bề mặt môi trường đặc khuẩn lạc chủng
Gluconacetobacter BHN2 ĐB có các tính chất khác so với chủng
Gluconacetobacter BHN2 như: có dạng trơn nhưng không bóng, khuẩn lạc bở, mất tính dai và nhớt.
Như vậy, hình thái khuẩn lạc cũng cần được coi là tiêu chí đánh giá chủng đã gây đột biến.
3.4.2. Hình thái tế bào
Tiến hành nhuộm kép 2 tiêu bản vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 và
Gluconacetobacter BHN2 ĐB sau đó sử dụng phương pháp quan sát so sánh sự giống và khác nhau của 2 chủng trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần như hình 3.11.
(A) (B)
Hình 3.11. Hình thái vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 (A) và Gluconacetobacter BHN2 ĐB (B)
Dưới kính hiển vi quang học, cả 2 chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB đều bắt màu hồng. Tuy nhiên về mặt hình thái tế bào chúng có sự khác nhau.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 có dạng hình que riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi. Vi khuẩn Gluconacetobacter
BHN2 ĐB có dạng hình ovan, hình quen ngắn, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi.
3.4.3. Điểm sai khác giữa chủng Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB
Sau khi tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB nhận thấy giữa chúng có sự sai khác. Các đặc điểm sai khác này được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Điểm sai khác giữa chủng Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB
Điểm sai khác Trƣớc đột biến (BHN2) Sau đột biến (BHN2 ĐB) Hình thái khuẩn lạc Thời gian quan sát rõ khuẩn lạc 3 - 4 ngày 2 - 3 ngày Hình dạng Hình tròn, nhẵn hoặc xù xì. Mép bằng phẳng hoặc gợn sóng Hình tròn, nhẵn hoặc xù xì. Mép bằng phẳng hoặc gợn sóng Màu sắc Trắng hoặc trắng sữa Trắng hoặc trắng sữa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình thái tế bào
Hình dạng
Hình que riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi
Hình que hoặc cầu dài riêng lẻ hoặc xếp
thành chuỗi
Kích thước 1,5 - 2 µm 1-1,5 µm
Nhuộm Gram Bắt màu G- Bắt màu G-
Khả năng sinh
bào tử Không Không
Khả năng di
động Không Không
Như vậy, hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng trước và sau đột biến có sự khác biệt cơ bản. Chứng tỏ rằng: Đột biến tia UV làm thay đổi hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc. Quá trình đột biến làm biến đổi chủng giống ban đầu. Tuy nhiên chỉ quan sát về hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc chưa đủ để khẳng định chủng Gluconacetobacter BHN2 đã bị đột biến dưới tác động của tia UV. Cần nghiên cứu và so sánh đặc điểm sinh lý, sinh
hóa và đặc điểm sinh học phân tử của chủng đột biến và chủng gốc để có được những chỉ tiêu cụ thể về sự biến đổi này.
3.5. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 sau đột biến
Tiến hành lên men tạo màng BC tương tự theo 4 bước cơ bản: Nhân giống Hoạt hóa Tạo màng Thu màng
3.5.1. Nhân giống Gluconacetobacter BHN2 ĐB trên môi trường thạch nghiêng. nghiêng.
3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 thu nhận được sau khi xử lý đột biến được cấy truyền để nhân giống trên môi trường thạch nghiêng sau khi vi khuẩn phát triển đem đi bảo quản trong tủ lạnh. Quá trình cấy truyền này được tiến hành liên lục để tạo lượng sinh khối đủ cho quá trình hoạt hóa.Chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB trên thạch nghiêng được thể hiện qua hình 3.12.
Khi cấy trên thạch nghiêng, 3 mẫu đột biến ĐB 3, ĐB 5, ĐB 7 thể hiện đặc tính khác so với chủng Gluconacetobacter BHN2 ban đầu.Vi khuẩn mọc không tạo đường cấy rõ nét, bề mặt lồi ít, trong và mất tính nhớt, dai.
3.5.2. Nuôi chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường hoạt hóa thu sinh khối
Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối lần lượt từ 3 mẫu ĐB 3, ĐB 5, ĐB 7 từ các ống giống sau đó nuôi trong các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 theo tỉ lệ 3 ống giống/250ml dịch.
Tiến hành nuôi lắc các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 trong khoảng 1 - 1,5 ngày để thu sinh khối.
Kết quả khi tiến hành nuôi lắc dịch nhân giống cấp 1 được thể hiện qua hình 3.13.
Hình 3.13.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường hoạt hóa
Sau quá trình nuôi lắc 1 - 1,5 ngày trong các bình chứa dịch nhân giống có màu trắng đục. Khác với chủng Gluconacetobacter BHN2 hình thành hệ sợi lơ lửng, các mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 không có dạng sợi, chỉ vẩn đục.
3.5.3. Tạo màng BC từ 3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7
Tiến hành lên men tạo màng BC từ 3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 trong khoảng 3 - 5 ngày được thể hiện qua hình 3.14.
Hình 3.14.Lên men tạo màng BC từ các mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7
Sau 5 ngày tiến hành lên men tĩnh, trên bề mặt các hộp lên men có hình thành một lớp màng mỏng. Tuy nhiên, bề mặt của lớp màng có độ dày mỏng khác nhau:
ĐB 3 có độ dày màng mỏng nhất, lớp màng mịn, đồng đều.
ĐB 5 có độ dày màng lớn nhất, bề mặt không đồng nhất, rất mủn. ĐB 7 có độ dày trung bình, bề mặt mủn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu ĐB3, ĐB5khi thu nhận chỉ là một lớp màng mỏng, bở, nhăn.
Kết quả hình ảnh các mẫu màng thu được từ 3 mẫu đột biến được thể hiện qua hình 3.15 và 3.16.
Hình 3.15.Màng BC từ mẫu ĐB3, ĐB5
Mẫu ĐB7 không có khả năng tạo được lớp màng mỏng mà chỉ có hệ sợi lơ lửng trong dịch lên men hoặc dạng váng mỏng.
Tiến hành nghiên cứu khả năng tạo màng qua 2 đợt đồng thời kiểm tra sự ổn định khả năng tạo màng và tính chất của các chủng đột biến này. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3.Khả năng tạo màng BC của các chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB lần thứ nhất
STT Kí hiệu chủng Thời gian
tạo màng Tính chất màng
1 ĐB3 68 ± 2 giờ Mỏng, dễ rách, nhăn
2 ĐB5 79± 2,5 giờ Mỏng, dễ rách, không đều,
nhăn
3 ĐB7 75 ±1 giờ Không tạo màng, dạng váng
Lên màng lần thứ nhất tôi không thu được 3 mẫu.Ở các hộp lên men với ĐB7 không có khả năng tạo màng, chỉ là lớp váng nổi trên bề mặt dịch lên men hoặc dạng sợi, mủn lơ lửng trong dịch lên men. Ở các hộp lên men với ĐB3, ĐB5, thu được một lớp màng mỏng bao phủ toàn bộ bề mặt hộp lên men. Tuy nhiên lớp màng này đều rất mỏng, nhăn, và mủn, không thể tiến hành thu nhận. Tôi tiến hành lên men lần thứ 2 với các chủng ĐB3, ĐB5, ĐB7.
Bảng 3.4. Khả năng tạo màng BC của các mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 lần thứ hai
STT Kí hiệu chủng Thời gian tạo
màng Tính chất màng
1 ĐB3 62±1,5 giờ Mỏng, nhăn, dễ rách
2 ĐB5 75 ± 2 giờ Rất mỏng, nhăn, không đều, dễ rách
Kiểm tra khả năng tạo màng của 3 mẫu qua 2 lần tiến hành thì không thu được màng BC thành phẩm. Có 3 mẫu ĐB3, ĐB5 tạo được 1 lớp màng mỏng trên bề mặt hộp lên men còn các mẫu ĐB7 không có khả năng tạo được màng.
Giải thích nguyên nhân của chủng sau đột biến mất khả năng tạo màng:
Tia UV đã tác động vào bộ máy di truyền của vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 làm thay đổi đoạn gen mã hóa khả năng tạo màng các chủng BHN2. Do vậy, khi gen mã hóa tạo màng bị thay đổi sẽ dẫn tới mất khả năng tạo màng ở các chủng đột biến.