Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
Chúng tôi tiến hành lấy máu ở tim của vịt nghi mắc DHV vào lúc sáng sớm, trước khi cho vịt ăn.
Máu lấy xong đưa nhanh vào ống EDTA, lắc nhẹ, bảo quản trong bình lạnh từ 2 - 80C.
Các chỉ tiêu huyết học được đo trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu và
được chạy bằng máy Cell – Dyn 3700 (hãng Abbort-Hoa kỳ) tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dòng tế bào theo kích thước tế bào, có nhân hay không có nhân, theo hình dạng nhân. Đếm trên toàn bộống mẫu máu xét nghiệm mà không cần tách hay pha loãng mẫu.
- Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: + Số lượng hồng cầu (RBC, triệu/µl), (1mm3 = 1µl)
+ Hàm lượng huyết sắc tố (HGB, g/l). + Tỷ khối huyết cầu (HCT, %)
+ Thể tích trung bình hồng cầu (MCV, fl)
+ Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH, pg)
+ Số lượng bạch cầu (WBC, nghìn/µl) và công thức bạch cầu (%)
c) Phương pháp mổ khám:
Vịt bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ tất cả các khí quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể và lấy mẫu: Gan, lách, thận,… sau đó tiến hành ngâm bảo quản ở formol 10% để làm tiêu bản vi thể.
d) Phương pháp làm tiêu bản vi thể:
Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tẩm đúc parafin theo Robert (1969), Burn (1974), cắt dán mảnh bằng máy cắt chuyên dụng, nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Mỗi vịt bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc thành hai block. Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi đểđọc kết quả bệnh tích vi thể. Nếu block nào có 2 tiêu bản có bệnh tích trở lên thì chúng tôi coi là dương tính.
Quy trình làm tiêu bản: Các bước tiến hành
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37ºC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52ºC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin – Eosin,…
- Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là gan, thận, lách,… - Cốđịnh bệnh phẩm (mục đích để giết chết tổ chức).
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Vùi bệnh phẩm: Mục đích tạo ra các chất nền cho tổ chức dễ cắt. + Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 – 5mm. Đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ
từ 12 – 24 giờđể rửa sạch formol.
+ Khử nước: Cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn Cồn I: 3 giờ
Cồn II: 3 giờ
Cồn III: 3 giờ
Cồn IV: 12 giờ
Mục đích để khử nước ra khỏi tổ chức. + Khử cồn: Cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen Xylen I: 4 giờ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Xylen III: 12 giờ
Mục đích để khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được. Nếu để
quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
+ Khử xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định (paraffin có từ 3 – 5% sáp ong đã nấu, đảo nhiều lần thành môi trường đồng nhất ổn định, đặc chắc, không lẫn tạp chất, không bọt), gồm 3 lọ.
Parafin I: 6 giờ trong tủấm 56ºC Parafin II: 6 giờ trong tủấm 56ºC Parafin III: 12 giờ trong tủấm 56ºC
Mục đích để khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào.
Nếu nhiệt độ trên 56ºC thì miếng tổ chức sẽ giòn và dễ vỡ, khó cắt.