2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nghiên cứu trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng
longa L.) Bình Dương
2.3.1.1 Khảo sát quy trình trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng
Curcuminoid và tinh dầu đều là những thành phần có hoạt tính sinh học cao có mặt trong củ Nghệ vàng. Tuy nhiên, các quy trình trích ly curcuminoid trong công nghiệp hiện nay thƣờng bỏ qua lƣợng tinh dầu có trong củ nghệ và đều đi qua giai đoạn loại béo bằng dung môi hữu cơ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát tách curcuminoid kết hợp tách tinh dầu trong c ng một quy trình nhằm tận thu đƣợc nguồn tinh dầu từ củ Nghệ vàng, đồng thời bỏ qua giai đoạn loại béo để giảm thiểu lƣợng dung môi sử dụng. Để quy trình có tính thực tiễn và curcuminoid thành phẩm có khả năng ứng dụng đƣợc trong l nh vực thực phẩm và dƣợc phẩm, hệ dung môi ethanol – nƣớc đƣợc chọn để trích ly curcuminoid. Ethanol là dung môi không độc, h a tan tốt curcuminoid, tƣơng đối r tiền, có độ nhớt thấp, độ bay hơi vừa phải khá thích hợp cho việc trích ly curcuminoid.
Trên cơ sở đó, chúng tôi khảo sát 2 quy trình trích ly curcuminoid kết hợp tách tinh dầu (quy trình 1 + 2) trong đó với quy trình 1, tinh dầu đƣợc tách từ nguyên liệu củ nghệ tƣơi c n ở quy trình 2, tinh dầu đƣợc tách từ nguyên liệu nghệ khô (độ ẩm 10- 12%) trƣớc khi tách curcuminoid. Ngoài ra, để có thể đánh giá tốt hơn hiệu quả của các quy trình trên, chúng tôi tiến hành một quy trình trích ly curcuminoid ngay từ nguyên liệu nghệ khô mà không qua giai đoạn tách tinh dầu (quy trình 3).
Quy trình 1:
Củ nghệ tƣơi mua về rửa sạch, loại bỏ củ hƣ, cỏ tạp, cắt lát, xay nhỏ và tiến hành tách tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc trực tiếp có hồi lƣu trên
37
hệ thống chƣng cất Clevenger (8-9 giờ). Bã nghệ tƣơi sau khi tách tinh dầu đƣợc sấy ở nhiệt độ 50-60oC đến độ ẩm 10-12 %, sau đó đƣợc trích ly curcuminoid bằng ethanol 95 % trong thiết bị Soxhlet, tỷ lệ R/L 1/16 (g nguyên liệu/ml dung môi) trong thời gian 3 giờ (điều kiện trích ly Soxhlet đƣợc khảo sát và trình bày trong phụ lục 1). Sau khi trích ly, dịch trích đƣợc lọc, cô quay chân không c n 1/5 thể tích và để kết tinh ở nhiệt độ ph ng trong 10 giờ, lọc hút chân không thu sản phẩm.
Hình 2.1. Quy trình 1
Quy trình 2
Tiến hành tƣơng tự nhƣ quy trình 1, chỉ thay nguyên liệu nghệ tƣơi bằng nghệ khô độ ẩm 10-12 % : củ nghệ tƣơi cắt lát, sấy khô ở 50÷60oC đến độ ẩm 10÷12 %, xay nhỏ tiến hành tách tinh dầu. Sau đó, bã đƣợc sấy khô đến độ ẩm 10-12 % trƣớc khi trích curcuminoid.
Quy trình 3:
Củ nghệ tƣơi cắt lát, sấy khô ở 50÷60oC đến độ ẩm 10÷12 %, xay nhỏ, tiến hành trích ly curcuminoid (không tách tinh dầu).
Tính hiệu suất trích ly và xác định độ tinh khiết của curcuminoid thu đƣợc:
Hiệu quả của các quy trình đƣợc đánh giá dựa trên 2 yếu tố: hiệu suất trích ly curcuminoid (% khối lƣợng curcuminoid tinh thu đƣợc tính trên khối lƣợng nguyên liệu khô tuyệt đối ban đầu) và độ tinh khiết curcuminoid (nồng độ curcuminoid trong mẫu đƣợc tính dựa theo phƣơng pháp lập đƣờng chuẩn).
Độ tinh khiết curcuminoid (Ccurcuminoid) hay nồng độ curcuminoid có trong sản phẩm đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thu (UV−Vis) thông qua
Nghệ tƣơi 50 ÷ 60 oC Độ ẩm 10 ÷ 12 % Cắt lát, xay nhỏ Tách tinh dầu Trích ly Soxhlet curcuminoid Sấy khô Lọc chân không Cô đặc dịch trích Lọc chân không Curcumin thô Kết tinh, 10 giờ Cô quay chân không EtOH 95 % Thời gian: 3 giờ
38
việc lập đƣờng chuẩn sử dụng curcuminoid chuẩn (độ tinh khiết theo HPLC 99,9 %). Độ hấp thu của dung dịch mẫu và chuẩn trong ethanol đƣợc xác định trên máy UV-Vis Spectrophotometer Jenway 6505 (ph ng thí nghiệm Bộ môn Hữu cơ, khoa Hóa, Đại học BK TPHCM) tại bƣớc sóng 427 nm (phụ lục 2).
Hiệu suất trích ly curcuminoid (H%) của mỗi quy trình đƣợc tính nhƣ sau:
( )
(2.1)
Trong đó:
mtinh: là khối lƣợng curcuminoid tinh thu đƣợc: mtinh= mthô × Ccurcuminoid. (2.2) Ccurcuminoid (%): nồng độ curcuminoid trong mẫu sản phẩm thu đƣợc (xác định dựa vào đƣờng chuẩn UV –Vis).
mnlktđ: là khối lƣợng nguyên liệu khô tuyệt đối ban đầu. Nguyên liệu nghệ tƣơi sử dụng cho cả 3 quy trình có khối lƣợng là 200 g, độ ẩm 87 %, do đó khối lƣợng nguyên liệu khô tuyệt đối cho cả 3 quy trình mnlktđ = 200 × (100 - 87) % = 26 g (2.3)
2.3.1.2 Phân tích tính chất hóa lý, hàm lượng và thành phần tinh dầu, hàm lượng curcuminoid thu được bằng phương pháp GC-MS, HPLC và LC-MS
Tinh dầu sau khi tách (từ quy trình 1) đƣợc làm khan bằng Na2SO4, sau đó đƣợc tiến hành xác định một số tính chất hóa l và xác định thành phần bằng phƣơng pháp GC-MS (thực hiện tại trung tâm dịch vụ KHCN sắc k Hải Đăng). Điều kiện phân tích: máy GCMS-QP 2010 Shimadzu, cột SLP-5 ms, chiều dài 30 m, đƣờng kính 0,25 mm, bề dày phim 0,25 m, chƣơng trình nhiệt độ:
Nhiệt độ buồng hóa hơi: 250oC, thể tích tiêm: 1 μl ( chia d ng khí 1 %), khí mang Helium ( P = 75.4 kPa). Điều kiện phân tích MS: tác nhân bắn phá ion: EI+, electron energy: 0,95 kV, nhiệt độ bộ nguồn: 200oC, nhiệt độ bộ phận giao tiếp (interface): 250oC, khối phổ mẫu đƣợc so sánh với khối phổ chuẩn trong thƣ viện NIST Ver 2.0a. Để giúp đánh giá tốt hơn về tinh dầu củ Nghệ vàng Bình Dƣơng so với một số v ng nghệ khác, chúng tôi c ng đã thực hiện trích ly tinh dầu từ củ Nghệ vàng ở một số v ng khác nhƣ Đồng Nai, Quảng Nam, Nghệ An trên c ng thiết bị và điều kiện trích
60oC 80oC 180oC 200oC 290oC (1 phút) (6 phút) (5 phút) (25 phút)
10oC/phút
39
ly. Tinh dầu củ nghệ của các v ng sau khi trích ly sẽ đƣợc gửi phân tích thành phần c ng với tinh dầu củ Nghệ vàng Bình Dƣơng với cùng điều kiện phân tích nhƣ trên.
Độ tinh khiết curcuminoid trong mẫu curcuminoid thu đƣợc từ quy trình 1 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC tại trung tâm Dịch vụ và Phân tích thí nghiệm TPHCM.
Điều kiện chạy HPLC: cột nhồi chứa -NH2, kích thƣớc 5 m x 150 mm x 4,6 mm, đầu d UV. Chế độ chạy đẳng d ng, tốc độ d ng 0,7 ml/phút. Thể tích bơm mẫu 20 l. Pha động là hỗn hợp ethanol – nƣớc (95:5). Bƣớc sóng phát hiện của đầu d UV là 254 nm. Hàm lƣợng curcuminoid sẽ đƣợc xác định dựa trên tỷ lệ diện tích peak của mẫu thử so với diện tích peak của mẫu chuẩn.
Tỉ lệ các thành phần curcuminoid có trong mẫu c ng đƣợc xác định bằng HPLC- MS với đầu d UV tại trung tâm Đào tạo và Phát triển sắc ký TPHCM. Điều kiện chạy LC: cột pha đảo C18 (250 x 4,6 mm, 5 m), nhiệt độ cột: 40oC, pha động: acetonitrile/H3PO4 0,05 % tỉ lệ 55:45 (v/v), tốc độ d ng: 0,8 ml/phút, bƣớc sóng cài đặt cho đầu d UV-Vis là 422 nm.
2.3.1.3 Khảo sát trích ly curcuminoid bằng phương pháp đun hồi lưu trực tiếp có sự hỗ trợ vi sóng
Hiện nay việc sử dụng vi sóng hỗ trợ trong trích ly các hợp chất thiên nhiên đang rất đƣợc quan tâm nhờ vào ƣu điểm là tiết kiệm thời gian và năng lƣợng. Để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp này trong việc trích ly curcuminoid, chúng tôi c ng tiến hành khảo sát trích ly curcuminoid bằng phƣơng pháp đun hồi lƣu trực tiếp trong điều kiện vi sóng, so sánh với phƣơng pháp trích ly Soxhlet không có vi sóng (mục 2.3.1.1)
L vi sóng sử dụng trong các thí nghiệm: L vi sóng gia dụng Whirpool (công suất 800 W) đƣợc hiệu chỉnh theo tài liệu [138] và lắp ráp nhƣ trong hình 2.2.
40
Hình 2.2. Hệ thống trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng
Nguyên liệu đƣợc sử dụng cho mỗi thí nghiệm là 5 g bột nghệ khô (độ ẩm 10 %) đã qua giai đoạn tách tinh dầu. Các yếu tố đƣợc khảo sát:
Khảo sát nồng độ dung môi
Điều kiện: tỷ lệ R/L là 1/11 (g nguyên liệu/ml dung môi), thời gian trích ly 30 phút, nồng độ các hệ dung môi ethanol – nƣớc tính theo % thể tích ethanol (v/v) đƣợc khảo sát là 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %.
Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu (g)/dung môi (ml)
Điều kiện: dung môi ethanol 95 % (v/v) (từ khảo sát 1), thời gian trích 30 phút. Lƣợng dung môi d ng để trích ly lần lƣợt là 35 ml, 45 ml, 55 ml, 65 ml, 75 ml tƣơng ứng tỷ lệ R/L (g/ml) khảo sát là 1/7, 1/9, 1/11, 1/13, 1/15.
Khảo sát thời gian trích
Điều kiện : dung môi ethanol 95 % (v/v), tỉ lệ R/L là 1/11 (g/ml) (từ khảo sát 2). Thời gian chiếu sóng lần lƣợt khảo sát là 10, 20, 30, 40, 50 phút.