Các nghiên cứu về tổng hợp và hoạt tính sinh học của dẫn xuất curcumin

1 TỔNG QUAN

1.3 Các nghiên cứu về tổng hợp và hoạt tính sinh học của dẫn xuất curcumin

Các dẫn xuất và hợp chất tƣơng tự curcumin đƣợc tổng hợp thông qua việc biến đổi các nhóm chức đặc trƣng trên curcumin gồm các phản ứng biến tính nhóm OH, OCH₃ trên 2 vòng phenyl, biến tính nhóm methylene trung tâm, hệ liên hợp enone và cấu trúc -diketone. Ngoài ra, các dẫn xuất c ng có thể đƣợc tổng hợp thông qua phản ứng ngƣng tụ từ các thành phần có cấu trúc nhỏ hơn giữa các dẫn xuất của benzaldehyde và 2,4-pentanedione.

19

1.3.1 Các phương pháp tổng hợp một số dẫn xuất của curcumin

1.3.1.1 Thay đổi nhóm thế trên 2 vòng phenyl

Phƣơng pháp tổng hợp các dẫn xuất này chủ yếu thông qua phản ứng biến tính nhóm OH phenol, phản ứng demethyl hóa ArOCH3 và phản ứng ngƣng tụ giữa các dẫn xuất benzaldehyde với 2,4-pentanedinone.

Các phản ứng biến tính nhóm OH phenol đã đƣợc các nhóm tác giả thực hiện bao gồm: sulfoamoyl hóa, O-acyl hóa và O-glycosyl hóa.

 Sulfoamoyl hóa nhóm OH [88]:

 O-acetyl hóa OH [89], tổng hợp dẫn xuất di-O-acetyl-curcumin:

 O-acyl hóa OH, tổng hợp dẫn xuất di-O-glycinoyl-, di-O-alaninoyl- và di-O- piperoyl curcumin [89]:

Di-O-glycinoyl curcumin

 O-glycosyl hóa OH với tetra-O-acetyl glycopyranosyl chloride, tạo dẫn xuất 4,4’- di--D-glucopyranoside curcumin [89]

20

Nhóm OCH₃ trên v ng phenyl đƣợc biến tính chủ yếu bằng phản ứng demethyl hóa tạo cấu trúc ortho-hydroxyphenol [90, 91]

Ngoài ra, một phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều trong tổng hợp dẫn xuất của curcumin là thông qua phản ứng ngƣng tụ giữa các dẫn xuất của benzaldehyde và 2,4- pentanedione [88, 92]

Phƣơng pháp này có ƣu điểm là có thể đƣa nhiều nhóm thế khác nhau lên 2 v ng phenyl mà không phụ thuộc vào cấu trúc của curcumin.

Giai đoạn thứ nhất là phản ứng tạo phức giữa B2O₃ và acetylacetone giúp hạn chế phản ứng ngƣng tụ Knoevenagel. Tiếp theo benzaldehyde tƣơng ứng và base đƣợc thêm vào tạo phản ứng ngƣng tụ với phức boron-acetylacetone. Cuối c ng gia nhiệt với acid loãng giúp b gãy phức, hình thành sản phẩm [93].

21

1.3.1.2 Phản ứng trên nhóm -diketone

Các dẫn xuất trong nhóm này chủ yếu đi từ sự biến đổi cấu trúc -diketone của curcumin thông qua các phản ứng với các amine tạo imine, oxime, semicarbazone hoặc thông qua phản ứng với hydroxyamine, các hydrazine tạo dị v ng isoxazole, pyrazole curcumin và các dẫn xuất của pyrazole curcumin.

 Tổng hợp dẫn xuất imine, oxime [94]

 Tổng hợp curcumin semicarbazone, curcumin thiosemicarbazone [95, 96]:

Curcumin semicarbazone  Tổng hợp dẫn xuất isoxazole curcumin [94, 97-99]

Phản ứng trên đƣợc nhóm Mishra [99] thực hiện giữa curcumin với hydroxylamine hydrochloride (tỷ lệ mol 1/1) trong dung môi CH3COOH (85^oC, 6 giờ) nhƣng c ng đƣợc một số nhóm nghiên cứu thực hiện ở điều kiện acid trung bình hoặc yếu hơn trong dung môi ethanol (nhiệt độ hồi lƣu, 4 giờ ) [94], hoặc trong ethanol có bổ sung pyridine (tỉ lệ mol curcumin/NH2OH.HCl/pyridine 1/5/5) ở nhiệt độ hồi lƣu và thời gian phản ứng dài hơn, 48 giờ [97].

22

 Tổng hợp dẫn xuất pyrazole và phenylpyrazole curcumin [90, 94, 97, 99-102]:

Pyrazole curcumin

Pyrazole curcumin đƣợc nhiều nhóm tác giả tổng hợp sử dụng tác nhân hydrazine hydrate (tỷ lệ mol curcumin/hydrazine 1/1-1/2) trong CH₃COOH (nhiệt độ ph ng, 7 giờ hoặc ở 85oC, 6 giờ hoặc ở nhiệt độ hồi lƣu, 2 giờ) [88, 97, 99, 100, 102]. Phản ứng c ng đƣợc nhóm Shim [101] thực hiện với hydrazine hydrochloride trong dung môi methanol, bổ sung triethylamine (tỷ lệ mol curcumin/NH₂NH₂.HCl/Et₃N 2/1/1) và xúc tác CH3COOH ở nhiệt độ ph ng, 24 giờ.

Dẫn xuất của pyrazole curcumin [97] Các dẫn xuất của pyrazole curcumin đƣợc nhóm Narlawar [97] tổng hợp tƣơng tự nhƣ với pyrazole curcumin sử dụng tác chất là alkyl hydrazine hydrochloride trong dung môi methanol, bổ sung triethylamine (tỷ lệ mol curcumin/RNH₂NH₂.HCl/Et₃N 1/5/5) và lƣợng nhỏ xúc tác CH3COOH, ở nhiệt độ ph ng, 48 giờ.

Dẫn xuất hydroxyethyl pyrazole curcumin (R=-CH₂CH₂OH) đƣợc thực hiện trong toluene (tỷ lệ mol curcumin/RNH₂NH₂.HCl 1/2), xúc tác TFA (trifluoroacetic acid), nhiệt độ hồi lƣu trong 24-48 giờ.

23

Dẫn xuất của phenylpyrazole curcumin đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ với pyrazole curcumin, sử dụng tác nhân là dẫn xuất của phenylhydrazine hydrochloride [97, 99, 103, 104]. Dung môi sử dụng có thể là toluene (nhiệt độ hồi lƣu, 24-48 giờ) [97], hoặc CH₃COOH (nhiệt độ hồi lƣu, 8 giờ) [99]. Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin (R=p-COOH) đƣợc thực hiện với tác nhân 4- hydrazinobenzoic acid trong methanol, bổ sung triethylamine (tỷ lệ mol curcumin/hydrazine/Et₃N 2/1/1) và lƣợng nhỏ xúc tác CH₃COOH ở nhiệt độ ph ng trong 24 giờ [101].

1.3.1.3 Thế H methylene

Nhóm methylene trung tâm đƣợc biến tính thông qua các phản ứng cộng Michael, phản ứng alkyl hóa cấu trúc -diketone của curcumin và thông qua phản ứng ngƣng tụ aldol giữa dẫn xuất của benzaldehyde và dẫn xuất của 2,4-pentanedione.  Phản ứng cộng Michael (Michael addition) [105]:

 Phản ứng alkyl hóa C_ cấu trúc -diketone [106]:

 Phản ứng ngƣng tụ aldol [105]:

1.3.1.4 Khử hóa curcumin

Thông qua phản ứng khử hóa cấu trúc heptadienone của curcumin tạo các dẫn xuất tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin [62, 64, 106].

24

1.3.2 Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất curcuminoid

Để tăng sinh khả dụng của curcumin, nhóm Misha [107] đã thực hiện liên kết curcumin với các amino acid nhƣ glycine, D-alanine là những thành phần cơ bản trong tế bào vi khuẩn, với glucose, acetic acid là những thành phần trong thực phẩm dễ dàng đƣợc tiếp nhận bởi tế bào chất. Các thành phần này đƣợc xem là các chất liên kết sinh học (bioconjugate) sẽ đóng vai tr chất mang giúp curcumin dễ dàng hấp thu vào tế bào. Sau khi phân bố trong cơ thể, các liên kết tạo thành (ester, glucoside) sẽ thủy phân phóng thích curcumin tạo tác dụng dƣợc l . Nhóm đã xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của các dẫn xuất tạo thành. Với c ng nồng độ, hợp chất 4,4’-di-O-(glycinoyl-di-N-piperoyl) curcumin và 4,4’-di-O-acetyl-curcumin (hình 1.11) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với cefixime, một kháng sinh đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng. Hợp chất 4,4’-di-O-(glycinoyl-di-N-piperoyl) curcumin và 4,4’-di-O-piperoyl curcumin có hoạt tính kháng nấm gần nhƣ tƣơng đƣơng với

fluconazole, một loại thuốc kháng nấm khá thông dụng. Hoạt tính tăng lên của các dẫn xuất trên so với curcumin đƣợc tác giả l giải có thể nhờ sự tăng hấp thu vào tế bào, sự làm chậm quá trình chuyển hóa curcumin do liên kết mới đã giúp che 2 nhóm OH phenol, do vậy tạo nên nồng độ curcumin đủ lớn trong tế bào bị nhiễm bệnh.

Hình 1.11. 4,4’-di-O-(glycinoyl-di-N-piperoyl)curcumin, 4,4’-di-O-acetyl curcumin và 4,4’-di-O-piperoyl curcumin [107]

25

Vai tr của các chất liên kết sinh học trong việc cải thiện sinh khả dụng của curcumin c ng đƣợc chứng minh trong 1 nghiên cứu khác [108] khi các dẫn xuất monoester và diester của curcumin với valine, glycine, glutamic acid và demethylenated piperic acid (hình 1.12) đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hơn so với curcumin và tƣơng đƣơng với amoxyclav. Ngoài ra, hoạt tính một số monoester mạnh hơn so với diester tƣơng ứng, chứng tỏ vai tr nhóm OH phenol còn lại trên curcumin, nhóm OH tự do này có thể giúp tạo liên kết tại vị trí hoạt động.

Hình 1.12. Diester của curcumin với valine, glycine, glutamic acid và demethylenated piperic acid [108]

Các dẫn xuất di-piperoyl curcumin, di-glycinoyl curcumin (hình 1.11) c ng đƣợc chứng minh có khả năng gây tiến trình tự hủy tế bào mạnh hơn curcumin [109].

Mặc d chƣa có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ giữa sự biến đổi cấu trúc curcumin với sự cải thiện tính khả dụng sinh học của curcumin, rất nhiều dẫn xuất c ng đã đƣợc chứng minh in vitro và in vivo có hoạt tính sinh học cao hơn curcumin.

Nghiên cứu của nhóm Chen về hoạt tính kháng peroxide hóa LDL (low density lipoprotein) ở ngƣời của 9 dẫn xuất khác nhau của curcumin (hình 1.13) gây ra bởi gốc tự do AAPH tan trong nƣớc hoặc ion Cu2+đều cho kết quả 2>3>1~4~5>6~7~8~9.

26

Các hợp chất 7, 8, 9 không chứa nhóm phenol không có hoạt tính hoặc hoạt tính yếu hơn các dẫn xuất c n lại, đồng thời, hợp chất 2 và 3 có hoạt tính mạnh hơn curcumin chứng tỏ vai tr quan trọng của nhóm ortho-hydroxyphenol và ortho- methoxyphenol trong hoạt tính kháng oxy hóa. Từ kết quả thực nghiệm và tính toán, nhóm thế ortho-hydroxyphenol đƣợc đề nghị giúp sản phẩm oxy hóa trung gian, gốc

ortho-hydroxyphenol, bền hơn nhờ liên kết hydro nội phân tử. Ngoài ra, gốc tự do

ortho-hydroxyphenol c ng dễ dàng bị oxy hóa tiếp thành sản phẩm cuối c ng ortho – quinone (hình 1.14).

Hình 1.14. Sự hình thành gốc tự do ortho-hydroxyphenol [39]

Vai tr của nhóm ortho-methoxyphenol trong hoạt tính kháng oxy hóa c ng đƣợc chứng minh trong nghiên cứu của nhóm Selvam [100], khi các dẫn xuất ortho- methoxyphenol nhƣ curcumin, pyrazole curcumin (4), isoxazole curcumin (7) (hình 1.15) đều thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH mạnh hơn so với trolox và các dẫn xuất c n lại, chứng tỏ vai tr của nhóm ortho-methoxy trong việc giúp tăng độ bền gốc tự do phenoxy tạo thành.

Hình 1.15. Các dẫn xuất trong nghiên cứu của nhóm Selvam [100]

C ng trong nghiên cứu của nhóm này [100], các cấu trúc pyrazole và isoxazole curcumin đã giúp tăng đáng kể khả năng ức chế enzyme COX-2 so với COX-1. Khả năng ức chế chọn lọc COX-2/COX-1 đóng vai tr quan trọng trong hiệu quả của thuốc kháng viêm thế hệ mới. Pyrazole curcumin (4) c ng thể hiện hoạt tính kháng viêm in vivo cao hơn curcumin trên chân chuột bị ph gây ra do carrageenan. Thay đổi các

27

nhóm thế khác nhau trên 2 v ng thơm của curcumin c ng đƣợc chứng minh gây ảnh hƣởng lên khả năng ức chế COX-2 [110], trong đó nhóm F ở vị trí ortho so với OH giúp tăng độ chọn lọc lên hoạt tính ức chế enzyme này.

Nhóm Zang [92] khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất curcumin với các d ng tế bào ung thƣ: HepG2, SMMC-7221 (gan), CT26 (ruột kết), HeLa (cổ tử cung), Skov3 (buồng trứng), A549 (phổi) cho thấy khi thay OH bằng các nhóm có chứa proton có khả năng phân ly (1A, 1B, 1C, hình 1.16), các dẫn xuất tạo thành thể hiện hoạt tính mạnh, cao hơn và chọn lọc hơn curcumin trên các d ng tế bào khảo sát.

Hình 1.16. Các dẫn xuất trong nghiên cứu của nhóm Zang [92]

Nhóm Ishida [90] đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của 32 dẫn xuất và chất tƣơng tự curcumin với nhiều d ng tế bào ung thƣ khác nhau. Trong khi curcumin không thể hiện hoạt tính với hầu hết các d ng tế bào khảo sát, pyrazole curcumin (chất 4, hình 1.17) lại thể hiện phổ hoạt tính gây độc tế bào rộng với ED₅₀ từ 1 đến 3,9

g/ml với nhiều d ng tế bào ung thƣ: KB, KB-VIN (biểu mô miệng), A549 (phổi), CAK1-1 (thận), MCF-7 (ngực), 1A9 (buồng trứng), HCT-8 (ruột hồi), SK-MEL-2 (da), U87MG (não), HOS (gan), PC3, LNCaP (tuyến tiền liệt), HepG2 (gan). Dimethylcurcumin (8) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc với KB, trimethylcurcumin (9) c ng dƣơng tính với một vài d ng tế bào (1A9, U87MG, HOS).

28

Kết quả nghiên cứu cho thấy khi chuyển hóa thành phần keto-enol thành dạng pyrazole tƣơng ứng đã làm tăng hoạt tính gây độc với nhiều d ng tế bào ung thƣ, trong số đó dẫn xuất pyrazole curcumin thể hiện hoạt tính với tất cả các d ng tế bào khảo sát, trong khi dẫn xuất pyrazole của DMC và BDMC thể hiện hoạt tính chọn lọc hơn với 1A9.

Một nghiên cứu khác [94] với các dẫn xuất enaminone, oxime và dị v ng isoxazole curcumin (hình 1.18) trên các d ng tế bào ung thƣ HA22T/VGH (gan), MCF-7 (ngực) và dạng biến thể đa kháng thuốc của nó MCF-7R cho thấy các dẫn xuất isoxazole và benzyl oxime curcumin cho hoạt tính tăng lên trên cả 3 d ng tế bào. Đối với d ng HA22T/VGH, benzyl oxime curcumin thể hiện sự ức chế kích hoạt yếu tố NF-kB. Từ các kết quả nghiên cứu, có thể thấy cấu trúc -diketone của curcumin không phải đóng vai tr thiết yếu trong hoạt tính kháng ung thƣ của hợp chất này. Điều này c ng tƣơng đồng với các kết quả nghiên cứu khác khi biến đổi cấu trúc - diketone thành các dị v ng isoxazole và pyrazole giúp tăng khả năng ức chế enzyme COX-2 [100]. Đây là enzyme có mặt trong tất cả các d ng tế bào ngƣời, đƣợc chứng minh liên quan nhiều mặt đến quá trình phát triển ung thƣ và sự kháng thuốc. Trong một nghiên cứu khác, dẫn xuất pyrazole curcumin ức chế với độ chọn lọc cao sự tăng trƣởng tế bào bovine aortic (tế bào động mạch chủ nội mô ở b ) và đƣợc xem là tác nhân kháng tăng trƣởng mạch tiềm năng [101].

Hình 1.18. Các dẫn xuất trong nghiên cứu [94]

Trong nƣớc, nhóm tác giả Đào H ng Cƣờng, Lê Hải Lợi (đại học Đà Nẵng) [111] đã tổng hợp dẫn xuất pyrazole curcumin và isoxazole curcumin, nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế gốc tự do DPPH của chúng. Kết quả cho thấy hai dẫn xuất trên đều có khả năng kháng oxy hóa, có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn

29

dẫn xuất này đều kém hơn so với curcumin. Trong nghiên cứu này, các sản phẩm tổng hợp đƣợc có nhiệt độ nóng chảy, màu sắc khá khác biệt so với các bài báo quốc tế đã đƣợc công bố [94, 99, 100].

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy việc biến đổi cấu trúc curcumin c ng là một trong những phƣơng pháp quan trọng giúp cải thiện hoạt tính sinh học của curcumin, trong đó các cấu trúc pyrazole và isoxazole curcumin đã đƣợc nhiều nghiên cứu chứng minh có nhiều triển vọng trong việc cải thiện hoạt tính kháng ung thƣ của curcumin.

Chính vì vậy, trong đề tài nghiên cứu này, các dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcuminoid được định hướng tổng hợp nhằm khảo sát thêm về hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư của các dẫn xuất này.

1.4 Giới thiệu về tinh dầu và các phƣơng pháp trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng từ củ Nghệ vàng

1.4.1 Giới thiệu về tinh dầu củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.)

C ng với curcuminoid, tinh dầu c ng là thành phần có giá trị mang lại hoạt tính sinh học cho củ Nghệ vàng. Tinh dầu củ Nghệ vàng chiếm ~ 18 % gồm các thành phần chính nhƣ turmerone, ar-turmerone, curlone, ar-curcumene, cymene, cineol…[112]. Hàm lƣợng tinh dầu c ng nhƣ các thành phần chính trong tinh dầu thay đổi lớn ở các v ng nghệ khác nhau. Trong nghiên cứu của nhóm N. K. Leela [113], tinh dầu củ Nghệ vàng v ng Calicut, Ấn Độ trích bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc chiếm 3,8 % (tính trên khối lƣợng khô) với các thành phần chính ar- tumerone (31 %), turmetone (10 %), curlone (10,6 %), ar-curcumene (6,3 %), p- cymene (3 %), 1,8-cineol (2,4 %). Tuy nhiên, thành phần chính tinh dầu củ nghệ ở các v ng khác nhƣ ở Gorakhpur [114] lại gồm ar-tumerone (51,7 %), ar-tumerol (11,9 %), -bisbolene (10,7 %), zingiberene (10,2 %), -caryophyllene (5,6 %), ar- curcumene (3,8 %) hoặc ở Lower Hymalaya, phía Bắc Ấn Độ [115] lại khá khác biệt gồm -turmerone (44,1 %), -turmerone (18,5 %) và ar-turmerone (5,4 %). C ng với phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, tinh dầu củ Nghệ vàng vùng North Central Nigeria [116] thu đƣợc có hàm lƣợng 1,24 % (thể tích/khối lƣợng khô) với các thành phần chính -bisbolene (13,9 %), trans-ocimene (9,8 %), myrcene (7,6 %), 1,8-

30

cineole (6,9 %), -thujene (6,7 %) và thymol (6,4 %), trong khi Nghệ vàng ở Bangladesh [117] lại cho thành phần chính ar-tumerone (27,8 %), tumerone (17,2 %), curlone (13,8 %), 2-carene (4,8 %), zingiberene (4,4 %) và β-sesquiphellandrene (5,6 %).

Việt Nam có nhiều v ng Nghệ vàng khác nhau nhƣ ở H a Bình, Hƣng Yên, V nh Phúc, Đồng Nai, Bình Dƣơng…tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào thành phần curcuminoid. Thành phần và hoạt tính tinh dầu từ củ Nghệ vàng ở các v ng khác nhau chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Các công trình của các nhóm tác giả Phan Tống Sơn [118] và Đỗ Đình Rãng [119] trên một số v ng Nghệ vàng ở phía Bắc cho thấy, tinh dầu củ Nghệ vàng chứa lƣợng lớn turmerone, trong đó Nghệ vàng ở H a Bình chứa 30 % turmerone và 31 % ar-turmerone.

Nhiều nghiên cứu cho thấy tinh dầu Nghệ vàng có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm khá tốt. Trong nghiên cứu của nhóm K. Norajit [120], tinh dầu củ Nghệ vàng ở Bangkok (Thái Lan) với các thành phần chính turmerone (50 %), curlone, -farnesene và -zingiberene thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với các dòng vi khuẩn

Staphlylococcus aureus, Bacillus cereus và Listeria monocytogenes. Tinh dầu củ Nghệ vàng vùng Uttarakhand (Ấn Độ) với hàm lƣợng chiếm 8,2 % (thể tích / khối lƣợng khô) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với các dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, E.coli, Enterobacter aerogenes, Staphlylococcusaureus và Proteous mirabilis [121]. Ngoài ra nhiều nghiên cứu khác c ng cho thấy tinh dầu củ Nghệ vàng có khả năng kháng khuẩn với Bacillus macerans, Bacillus licheniformis, Azotobacter, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus moragini, Shigella, Klebsiella aerogenes, Corynebacterium diphthriae và -

hemolytic streptococci [122-125].

Tinh dầu từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) còn đƣợc chứng minh có hoạt tính kháng nấm mạnh, đặc biệt là đối với Aspergillus niger (in vitro) và một số loại nấm khác (Physalospora tucumanesis, Ceratocystis paradoxa, Sclerotium solfsii, curvularia lunata, Helminthosporium sacchari, Fusarium moniliforme vaz. subglutinans, Cephalosporium sacchari) [126].