2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4 Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu, curcuminoid và các dẫn
curcuminoid tổng hợp được
2.3.4.1 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa
a. Phƣơng pháp quét gốc tự do DPPH
(Thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM )
Ở mức độ in vitro, các chất nghiên cứu đƣợc đánh giá sàng lọc tác dụng kháng oxy hoá theo phƣơng pháp thử nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl). Khả năng quét gốc tự do DPPH đƣợc xác định bằng sự giảm độ hấp thu ở λ = 515 nm, do gốc DPPH bị khử bởi chất kháng oxy hoá (AH) [139].
Hình 2.3. Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá [139]
Chất đối chứng: vitamin C (L-ascorbic acid)
Phƣơng pháp thực hiện: 0,5 ml mẫu thử (hoặc 0,5 ml methanol đối với mẫu trắng đối chứng) pha loãng ở các nồng độ khác nhau trong methanol đƣợc cho phản ứng với đồng lƣợng DPPH 1 mM trong methanol và thêm methanol cho vừa đủ 4 ml. Các ống nghiệm đƣợc đậy kín, lắc đều và để trong tối ở nhiệt độ ph ng trong 30 phút, sau đó đo mật độ quang (OD) ở bƣớc sóng λ = 515 nm. Xây dựng đồ thị phụ thuộc % HTCO (công thức 2.5) theo nồng độ chất hay dung dịch cần đo, từ đó xác định nồng độ của mẫu thử tƣơng ứng với giá trị % HTCO = 50 %. Đó chính là giá trị IC50 của mẫu thử, so sánh với IC50 của chất đối chứng là vitamin C.
Hoạt tính kháng oxy hoá (HTCO) đƣợc tính theo công thức (2.5):
(2.5)
Trong đó:
ODC: mật độ quang của mẫu trắng đối chứng, ODT: mật độ quang của mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm đƣợc biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo.
b. Phƣơng pháp MDA
50
Khả năng ức chế quá trình peroxide hoá lipid của các chất nghiên cứu đƣợc đánh giá thông qua việc xác định hàm lƣợng malonyl dialdehyde (MDA). MDA là sản phẩm của quá trình peroxide hóa lipid màng tế bào. MDA phản ứng với thiobartiburic acid (TBA), tạo thành phức trimethin (màu hồng) có hấp thu cực đại ở bƣớc sóng λ = 532 nm. Cƣờng độ màu của dung dịch tỉ lệ với hàm lƣợng MDA [139].
Chất đối chứng: trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid).
Phƣơng pháp thực hiện: 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm đƣợc cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch đồng thể não chuột và thêm đệm phosphate vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 15 phút, dừng phản ứng bằng 1 ml tricloacetic acid 10 %. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml thiobartiburic acid 0,8 % trong 15 phút, 100oC. Làm lạnh và tiến hành đo mật độ quang ở bƣớc sóng λ = 532 nm. Xây dựng đồ thị phụ thuộc % HTCO (công thức 2.5) theo nồng độ chất hay
dung dịch cần đo, từ đó xác định nồng độ của mẫu thử tƣơng ứng với giá trị % HTCO = 50 %. Đó chính là giá trị IC50 của mẫu thử, so sánh với IC50 của chất đối
chứng là trolox. Các số liệu kết quả thử nghiệm đƣợc biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo.
2.3.4.2 Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn – phương pháp MIC (Thực hiện tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh, Đại học Y dược Tp. Hồ Chí Minh)
Xác định hoạt tính kháng khuẩn với một số dòng vi khuẩn gram (+):
Streptococcus hemolyticus, Staphylococcus aureus, gram (-): Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella dysenteria và hoạt tính kháng nấm Candida albicans theo phƣơng pháp pha loãng trong bản thạch, ở các nồng độ hoạt chất 15,625; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000 g/ml, xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC.
2.3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng ung thư
a. Hoạt tính gây độc tế bào với 3 dòng tế bào: Hep-G2, RD, Lu
(Thực hiện tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Xác định hoạt tính kháng ung thƣ theo phƣơng pháp của Skelan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993). Phƣơng pháp hiện đang đƣợc áp dụng tại Viện nghiên
51
cứu ung thƣ Quốc gia của Hoa Kỳ (NCI) và Trƣờng Đại học Dƣợc, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Hoa Kỳ.
Phƣơng pháp thực hiện
D ng tế bào: HepG2 (Hepatocellular carcinoma – ung thƣ gan), Lu (Lung cancer – ung thƣ phổi), RD (Rhabdomyosarcoma - ung thƣ màng tim ). Các d ng tế bào ung thƣ này đƣợc cung cấp bởi viện Vệ sinh dịch tể Trung ƣơng.
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung L-glutamine, sodium piruvate, NaHCO3, PSF (Penicillin-Streptomycin sulfate-Fungizone), NAA (Non-Essential Amino acids), 10 % BCS (Bovine Calf Serum), Tripsin-EDTA 0,05 %, DMSO, TCA (Trichloro Acetic acid), Tris Base, PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulforhodamine B), acetic acid.
Chất chuẩn chứng dƣơng tính (có khả năng diệt tế bào ung thƣ): Ellipticine pha trong DMSO.
Mật độ quang đƣợc đo trên máy ELISA ở bƣớc sóng 495-515 nm.
Tính kết quả
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với chất đối chứng. Dựa vào kết quả đo đƣợc của chúng: OD (ngày 0), DMSO 10 % và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức (2.6):
(2.6)
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50 %) sẽ đƣợc chọn ra để thử nghiệm tiếp tìm giá trị IC50
Giá trị IC50: d ng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chƣơng trình Table curve theo thang giá trị logarit của đƣờng cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử (phƣơng trình 2.7) để tính giá trị IC50 .
( ) (2.7) Trong đó: y - nồng độ chất thử, x - giá trị CS (%)
52
(thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của GS. Ronald J Quinn tại viện Eskitis (Eskitis Institute for Cell and Molecular Therapies), Đại học Griffith, Australia)
Phƣơng pháp thực hiện: tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt (PC3) và tế bào thƣờng NFF ở ngƣời (neonatal foreskin fibroblast – nguyên bào sợi bao quy đầu mới sinh) đƣợc nuôi trong môi trƣờng RPMI (môi trƣờng d ng nuôi cấy tế bào thƣờng và tế bào bạch cầu khối u ở ngƣời) đƣợc cung cấp 10 % FBS (fetal bovine serum – huyết thanh nhau thai b ). Tế bào đƣợc nuôi trong môi trƣờng tạo ẩm chứa 5 % CO2 ở 37oC. Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc xác định sau 72 giờ ủ sử dụng thí nghiệm xác định sự tăng trƣởng tế bào Alamar Blue (Alamar Blue proliferation assay). 49,5 l môi trƣờng chứa 500 tế bào đƣợc cho vào các giếng trên bảng Falcon 384 giếng (Falcon black clear 384TC microtitre plate). Chuẩn bị dung dịch mẫu tinh 10 mM trong 100 % DMSO, sau đó đƣợc pha loãng 10 lần. 0,5 l dung dịch mẫu sau khi pha loãng đƣợc thêm vào giếng tế bào để đạt thể tích cuối c ng là 50 l. Khoảng nồng độ mẫu thử nghiệm cuối c ng từ 0,1 mM đến 10 pM (nồng độ DMSO cuối c ng 1 %). Mỗi nồng độ đƣợc thử nghiệm 3 lần. Tế bào và hợp chất đƣợc ủ trong 72 giờ, 37o
C, 5 % CO2 và độ ẩm 80 %. Sự tăng trƣởng tế bào đƣợc xác định bằng cách thêm 10 l dung dịch 60 % Alamar blue vào mỗi giếng trên bảng Falcon để đạt nồng độ cuối c ng là 10 % Alamar blue. Sau đó bảng đƣợc ủ ở 37oC, 5 % CO2 và độ ẩm 80 % trong 24 giờ. Fluorescent của mỗi giếng đƣợc đọc ở bƣớc sóng kích hoạt (excitation) 535 nm và bƣớc sóng phát xạ (emission) 590 nm trên máy Victor II Wallac plate reader (PerkinElmer, USA). Đƣờng cong tƣơng quan với 8 nồng độ đƣợc phân tích d ng phƣơng pháp hồi quy không tuyến tính và giá trị IC50 đƣợc xác định sử dụng chƣơng trình GraphPad Prism 5. Paclitaxel (taxol) đƣợc d ng là chất chuẩn dƣơng tính trong quá trình sàng lọc. Giá trị SI (selective index) đƣợc xác định theo công thức (2.8) :
( )
53
3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN