L ỜI CÁM ƠN
a/ Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản tôm sú ở các nhiệt độ biến
2.2.3.5. Xác định lượng Pseudomonas spp
Mục đích: để theo dõi sự biến đổi của vi sinh vật gây hư hỏng đặc trưng trong quá trình bảo quản Pseudomonas spp, xác định theophương pháp của
Chuẩn bị mẫu: cân 25g tôm sú + 225ml đệm phosphat, đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,…
Từ các nồng độ pha loãng trên, cấy chuyển 0,1 ml mẫu vào đĩa petri đã có sẵn môi trường IAvô trùng
(mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)
Dùng que cấy trang mẫu để cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 20 oC trong 4 ngày
Tính kết quả: vikhuẩn sinh H2Scó trong mẫu (cfu/g) Đếm khuẩn lạc có màu đen mọc trên các đĩa
Stanbridgeand & Board ( 1994) với một vài thay đổi nhỏ [75]. Quy trìnhđịnh lượng Pseudomonas sppđược tóm tắt nhưhình 2.10.
Hình 2.10. Quy trìnhđịnh lượng Pseudomanas spp
2.2.3.6.Xác định lượng Coliform
Mục đích: để đánh giá mức độ vệ sinh của nước cũng như điều kiện vệ sinh trong quá trình thu hoạch tôm, đánh giá ô nhiễm phân của nguồn nước…, và theo dõi sự biến động củaColiform ngay từ khi mới thu mua và trong quá trình bảo quản. Tiến hành thí nghiệm với các mẫu sau khi thu mua, xử lý và bảo quản tại các nhiệt độ ổn định và biến động. Phương pháp định lượng Coliform
Chuẩn bị mẫu: cân 25 g tôm sú + 225ml đệm phosphat, đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,…
Từ các nồng độ pha loãng trên, cấy chuyển 0,1 ml mẫu vào đĩa petri đã có sẵn môi trường Pseudomonas
vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)
Dùng que cấy trang mẫu để cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 20 oC trong 5 ngày
Tính kết quả: Pseudomonas spp có trong mẫu (cfu/g) Đếm khuẩn lạc có màu hồng mọc trên các đĩa
được quy định theo TCVN 4882: 2007. Quy trình định lượng Coliform được tóm tắt nhưhình 2.11.
Hình 2.11.Quy trìnhđịnh lượng Coliform 2.2.3.7. Xác định E.coli theo TCVN 6846-2007
Mục đích: để đánh giá mức độ vệ sinh của nước cũng như điều kiện vệ sinh trong quá trìnhđánh bắt tôm, đánh giá ô nhiễm phân của nguồn nước… và theo dõi sự biến động của E.coli ngay từ khi mới thu mua và trong quá trình bảo quản. Tiến hành thí nghiệm với các mẫu sau khi thu mua, xử lý và bảo quản tại các nhiệt độ ổn định và biến động. Phương pháp định lượng E.coli được quy định theo TCVN 6846-2007. Quy trình định lượng E.coli được tóm tắt như
Chuẩn bị mẫu: cân 25 g tôm sú + 225ml dung dịch đệm phosphat, đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
Chuyển 1ml mẫu 10-1, 10-2, 10-3vào cácống nghiệm 10 ml môi trường LSB, mỗi nồng độ cấy 3 ống lặp lại.
Lắc đều các ống nghiệm, ủ ở 35oC trong 24h
Tính kết quả: tra bảng Mac-Crandy xác định Coliform tổng số (MPN/g)
Hình 2.12. Quy trìnhđịnh lượng E.coli
Chuẩn bị mẫu: cân 25g tôm sú + 225ml dung dịch đệm phosphat, đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
Chuyển 1ml mẫu 10-1, 10-2, 10-3vào cácống nghiệm 10 ml môi trường LSB, mỗi nồng độ cấy vào 3ống
nghiệm.
Lắc đều các ống nghiệm, ủ ở 35oC trong 24h
Số ống dương tính ở mỗi nồng độ, cấy lên thạch EMB, ủ ở 35oC, 24h
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vàoống pepton casein, ủ ở 35oC, 24h
Nhỏ thuốc thử Kovac’s vàoống pepton casein
Tính kết quả: đếm số ống (+), tra bảng Mac-Crandy xác định E.coli (MPN/g)
2.2.3.8.Xác định Salmonella
Mục đích: để đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình thu hoạch tôm và mức độ nhiễm chéo của thực phẩm. Phương pháp định tính Salmonella được quy định theo TCVN 4829: 2005. Tóm tắt quy trìnhđịnh tính Salmonellađược thể hiện như hình 2.13.
Hình 2.13. Quy trìnhđịnh tính Salmonella
2.2.3.9.Xác định Staphylococcus aureus
Mục đích: để đánh giá điều kiện vệ sinh trong quá trình thu hoạch tôm. Phương pháp định lượng S.aureus theo TCVN 4830-1: 2005. Quy trìnhđịnh lượng S.aureusđược thể hiện như hình 2.14.
Chuẩn bị mẫu: cân 25 g tôm sú + 225ml dung dịch đệm phosphat, đồng nhất mẫu, ủ ở 35oC, 24h
Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RV, ủ ở 42 oC, 24h
Cấy phân lập trên môi trường chọn lọc XLD, ủ ở 35oC, 24h
Chọn khuẩn lạc đặc trưng để test sinh hóa
Kết luận Salmonelladương tính hay âm tính trong 25 gam mẫu
Hình 2.14. Quy trìnhđịnh lượng S.aureus
Chuẩn bị mẫu: cân 25 g tôm sú + 225ml dung dịch đệm phosphat, đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,…
Từ các độ pha loãng trên, chuyển 0,1 ml mẫu vào các đĩa petri đã có sẵn môi trường BP vô trùng.
Dùng que cấy trang trang mẫu để cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 35oC, 24h
Đếm các khuẩn lạc đặc trưng
Đếm các khuẩn lạc không đặc trưng
Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào
TSA ,ủ ở 35 oC, 24 giờ
Lấy 5 khuẩn lạc không đặc trưng cấy vào TSA ,ủ ở
35oC, 24 giờ
Thử nghiệm ngưng kết Coagulase
Tỉ lệ khuẩn lạc đặc trưng, coagulase (+) Tỉ lệ khuẩn lạc không đặc trưng, coagulase (+)
2.2.3.10 .Xác định Listeria monocytogenes
Mục đích: để đánh giá mức độ vệ sinh của nguồn nước cũng như điều kiện vệ sinh trong quá trình đánh bắt tôm. Phương pháp định lượng Listeria monocytogenes được tiế hành theo Trần Linh Thước [23]. Tóm tắt quy trình định lượng Listeria monocytogenesnhưhình 2.15.
Chuẩn bị mẫu: cân 25g tôm sú + 225ml dung dịch đệm phosphat, đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
Chuyển 1ml mẫu 10-1, 10-2, 10-3vào cácống nghiệm 10 ml BGBL, mỗi nồng độ cấy vào 3ống nghiệm.
Lắc đều các ống nghiệm, ủ ở 35oC trong 48h
Số ống dương tính ở mỗi nồng độ, cấy lên thạch OXA,ủ ở 35oC, 24h
Ghi nhận các ống BGBL (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
Xác định ống dương tính với Listeria monocytogenes
Tính kết quả: tra bảng Mac-Crandy xác địnhListeria monocytogenes (MPN/g)
2.2.3.11 .Xác định Vibrio
Mục đích: để đánh giá mức độ vệ sinh của nguồn nước, điều kiện vệ sinh trong quá trình thu hoạch tôm. Phương pháp định tính Vibrio được tiến hành theo Trần Linh Thước [23]. Tóm tắt quy trìnhđịnh tính Vibrionhưhình 2.16.
Hình 2.16.Quy trìnhđịnh tính Vibrio
2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) trên phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) với kiểm định Duncan để kiểm tra sự khác nhau giữa các giá trị trung bình với mức ý nghĩa = 0,05. Sử dụng phần mềm Excel (Office 2007, Microsoft, USA) để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị.
Chuẩn bị mẫu: cân 25g tôm sú + 225ml dung dịch pepton kiềm, đồng nhất mẫu, ủ ở 35oC, 24h
Cấy phân lập trên môi trường chọn lọc TCBS, ủ ở 35oC, 24h
Chọn khuẩn lạc đặc trưng để test sinh hóa
Kết luận Vibriodương tính hay âm tính trong 25 gam mẫu
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định các vi sinh vật ban đầu trên tôm sú
Tôm sú sau khi thu mua được bảo quản bằng nước đá xay và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật gây hư hỏng đặc trưng và gây bệnh hiện diện trên tôm sú nguyên liệu như: TVC, Coliform, E.coli, Vibrio, Salmonella, S. aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas,
vi khuẩn sinh H2S. Kết quả kiểm tra thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Mật sốvi sinh vật gây hư hỏng đặc trưng và gây bệnh hiện diện
trên tôm sú nguyên liệu
Chỉ tiêu kiểm tra Mật số vi sinh vật Mật số vi sinh vật cho phép
Tiêu chuẩn, nguồn tài liệu
tham khảo TVC 105 (cfu/g) 106cfu/g 46/2007/QĐ- BYT Coliform 93 MPN/g E.coli 43 MPN/g 102cfu/g 46/2007/QĐ- BYT S. aureus - 102cfu/g 46/2007/QĐ- BYT
Listeria monocytogenes 0 (cfu/g)
Pseudomonas spp 5,5 103(cfu/g) Vi khuẩn sinh H2S 2,3 103(cfu/g)
Salmonella Không phát hiện
trong 25g mẫu Không có mặt trong 25g hoặc 25ml mẫu 46/2007/QĐ- BYT
Vibrio parahaemolyticus Không phát hiện
trong 25g mẫu 10 2
cfu/g 46/2007/QĐ- BYT
Vibrio cholerae Không phát hiện
trong 25g mẫu
trú tự nhiên trên tôm lúc này chưa phát triển, nhưng số lượng vi sinh vật có thể tăng do lây nhiễm thêm từ các dụng cụ chứa đựng, chuyên chở, từ bàn tay của người trực tiếp tiếp xúc với tôm… Nếu bảo quản không đúng cách, số vi sinh vật lây nhiễm này cùng với số vi sinh vật thường trú trên nguyên liệu tăng một cách nhanh chóng sẽ làm cho chất lượng nguyên liệu giảm mạnh.
Theo bảng 3.1 cho thấy: mật độ của TVC, Coliform, E.coli, S.aureus, Pseudomonas spp, vi khuẩn sinh H2S lần lượt là: 105 cfu/g, 93 MPN/g, 43 MPN/g, 102 cfu/g, 5,5 x 103 cfu/g, 2,3 x 103cfu/g và không thấy sự có mặt của
Salmonella, Vibrio, Listeria monocytogenes. Qua đây ta thấy lượng vi sinh vật ban đầu trên tôm sú nguyên liệu khá phong phú gồm cả những vi sinh vật gây bệnh và gây hỏng đặc trưng. Từ kết quả khảo sát trên, chọn TVC, Coliform, E.coli, Pseudomonas spp, vi khuẩn sinh H2S là các chỉ tiêu vi sinh vật nghiên cứu chính. Và để đảm bảo chất lượng tôm sú tốt nhất cần giám sát nhiệt độ và thời gian bảo quản nguyên liệu ngay sau khi thu hoạch và cũng là biện pháp hữu hiệu nhất để giảm tối đa lượng vi sinh vật ban đầu kéo dài thời gian bảo quản tôm sú, đảm bảo an toàn thực phẩm. Việc tìm ra nhiệt độ và thời gian bảo quản thích hợp mà tại đó lượng vi sinh vật ít biến đổi nhất, đảm bảo chất lượng và an toàn vệ sinh của nguyên liệu tốt nhất là vấn đề cần nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quảnghiên cứuảnh hưởng của nhiệt độ ổn định tới sựbiến đổi của một sốvi sinh vật gây hư hỏng đặc trưng và gây bệnh hiện diện trên tôm sú nguyên liệu, biến đổi của tổng bazơ nitơ bay hơi(TVB-N), chất lượng cảm quan QIM theo thời gian bảo quản lạnh
Tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.4 kết quả thu được thể hiện ở bảng phụ lục 3, phụ lục 4, phụ lục 5, phụ lục 6, phụ lục 7. Từ kết quả của lô khảo sát trên, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.5và thu được kết quả như sau.
3.2.1. Biến đổi của tổng số vi sinh vật hiếu khí phát triển ở nhiệt độ
thấp trong quá trình bảo quản tôm sú nguyên liệuởnhiệt độ ổn định
Kết quả xác định số lượng vi sinh vật hiếu khí phát triển ở nhiệt độ thấp trên nguyên liệu tôm sú thay đổi theo nhiệt độ và thời gian trong quá trình bảo quản được thể hiện ở hình 3.1 và từ bảng phụ lục 8 đến phụ lục 17.
Hình 3.1. Sự biến đổi của TVC trên nguyên liệu tôm sú trong quá trình bảo
quản ở nhiệt độ ổn định
Kết quả trên hình 3.1 cho thấytổngsố vi sinh vật hiếu khi phát triển ở nhiệt độ thấp ban đầu ứng với từng chế độ bảo quản: 1 ± 1 oC, 4 ± 1oC, 9 ± 1oC, 15 ± 1oC và 19 ± 1 oC lần lượt là: 1,4 x 105
cfu/g, 8,0 x 105cfu/g, 3,1 x 104 cfu/g, 1,1 x 103cfu/g và 1,2 x 104cfu/g. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả những nghiên cứu trước rằng tổng số vi sinh vật hiếu khí có trên tôm tươi thay đổi từ 2,5 x 102 cfu/g đến 2,0 x 106 cfu/g [55], [59], [61], [65]. Tại mỗi chế độ bảo quản theo thời gian chúng có sự biến thiên nhưng nhìn chung có xu hướng gia tăng cụ thể là: bảo quản ở nhiệt độ 1 ± 1oC TVC ban đầu là 1,4 x 105cfu/g, tại
1,0E+00 1,0E+01 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07 1,0E+08 1,0E+09 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TV C (cfu/g )
Thời gian bảo quản (ngày)
1 ± 1°C 4 ± 1°C 9 ± 1°C 15 ± 1°C 19 ± 1°C
đến ngày bảo quản thứ 6 vượt mức cho phép 106cfu/g (1,2 x 106 cfu/g) và tiếp tục tăng cho đến ngày bảo quản thứ 10 là 1,9 x 108cfu/g. Bảo quản ở 4 ± 1oC
TVCban đầu là 7,9 x 105cfu/g, TVC giảm xuống sau 2 ngày bảo quản tiếp theo cụ thể tại ngày bảo quản thứ 2 là 3,6 x 105 cfu/g, đến ngày bảo quản thứ 3 thì
TVCđã vượt quá giới hạn cho phép 106cfu/g (3,9 x 106cfu/g) và tăng đến ngày bảo quản thứ 6 là 4,7 x 108 cfu/g. Bảo quản ở 9 ± 1oC TVCban đầu là 3,1 x 104 cfu/g sau gần 1,2 ngày bảo quản (28 giờ) TVC tăng lên 5,7 x 104cfu/g và sau 1,5 ngày (30 giờ) giảm xuống còn 5,2 x 104
cfu/g và sau đó tăng đột ngột đến ngày bảo quản thứ 2 đã vượt mức cho phép 106cfu/g (2,0 x 107cfu/g) sau đó chúng có sự biến thiên và đến ngày bảo quản thứ 3 là 1,0 x 108 cfu/g. Bảo quản ở 15 ± 1oC TVC ban đầu là 1,1 x 103cfu/g theo thời gian bảo quản TVC tăng liên tục đến thời điểm bảo quản được 1,3 ngày (32 giờ) là 3,1 x 105 cfu/g nhưng sau 0,3 ngày bảo quản tiếp theo đó là thời điểm 1,6 ngày (39 giờ) thì vượt quá ngưỡng cho phép 106cfu/g (3,7 x 107 cfu/g) và đến ngày bảo quản thứ 2 là 1,9 x 108 cfu/g. Bảo quản ở 19 ± 1oC TVC ban đầu 1,2x 104cfu/g, tại thời điểm 0,3 ngày bảo quản (8 giờ) chúng có xu hướng giảm và cụ thể TVC là 4,5 x 103 cfu/g, sau 0,5 ngày (12 giờ) tăng lên 5,3 x 103cfu/g và chúng tiếp tục tăng cho đến thời điểm 0,9 ngày bảo quản (21 giờ) là 8,0 x 104 cfu/g và sau 1 ngày bảo quản TVCđã vượt quá ngưỡng cho phép 106cfu/g (1,3 x 107cfu/g).
Số lượng và chủng loại vi sinh vật trên tôm phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ nước, cách thu hoạch, kích cỡ tôm, thành phần môi trường, dinh dưỡng, … Và trong quá trình bảo quản, nhiệt độ thấp sẽ ức chế hoạt động enzyme,ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất của vi sinh vật, thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng.Như vậy tốc độ của TVCtăng càng nhanh khi tôm sú nguyên liệu bảo quản ở các nhiệt độ càng cao, và sự gia tăng này tương đồng với việc giảm rất nhanh chất lượng cảm quan của tôm bảo quản lạnh. Theo Dương Thị Phượng Liên và cộng sự (2011) [16], tôm sú nguyên liệu bảo quản trong nước đá ở 0 –1oC thời gian bảo quản
kéo dài được 10 ngày (tổng số vi sinh vật hiếu khí 1,0 x 105cfu/g), 1 – 2 oC thời gian bảo quản kéo dài được 9 ngày (tổng số vi sinh vật hiếu khí 1,6 x 105 cfu/g), ở 2 – 3 oC và 3 – 4 oC thời gian bảo quản kéo dài 8 ngày (tổng số vi sinh vật hiếu khí tương ứng là 1,2 x 105cfu/g và 1,1 x 105cfu/g). Trong nghiên cứu này thời gian bảo quản tôm sú nguyên liệu ở nhiệt độ 1 ± 1 oC là 4 ngày
(TVC: 6,9 x 105 cfu/g), ở 4 ± 1 oC là 2 ngày (TVC: 3,9 x 105cfu/g). Sự khác nhau này được giải thích như sau: nguồn nguyên liệu thu hoạch từ các nguồn khác nhau nên mức độ sạch khác nhau, cách bảo quản khác nhau, trong thí nghiệm của Dương Thị Phượng Liên tôm sú nguyên liệu được bảo quản trong nước đá trong thí nghiệm này tôm sú được xếp vào khay xốp bao PE và bảo quản bằng không khí lạnh.
Vậy để đảm bảo tôm sú nguyên liệu đạt tiêu chuẩn vi sinh vật, dựa trên chỉ
tiêu TVC thì:
- Ở1 ± 1oC, thời gian bảo quản tôm sú kéo dài 4 ngày (TVC: 6,9 x 105cfu/g). - Ở4 ± 1oC, thời gian bảo quản tôm sú kéo dài 2 ngày (TVC: 3,9 x 105cfu/g). - Ở9 ± 1oC, thời gian bảo quản tôm sú kéo dài 1,5 ngày (36 giờ)(TVC: 2,5 x
104cfu/g).
- Ở15 ± 1 oC, thời gian bảo quản tôm sú kéo dài 1,3 ngày (32 giờ) (TVC: 3,1
x 105cfu/g).
- Ở19 ± 1 oC, thời gian bảo quản tôm sú kéo dài 0,9 ngày (21 giờ) (TVC: 8,0
x 104cfu/g).
3.2.2. Biến đổi của Pseudomonas spp trong quá trình bảo quản tôm sú nguyên liệuởnhiệt độ ổn định