L ỜI CÁM ƠN
1.7. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến đề tài
Theo Lannelongue và cộng sự (1982) thì thời hạn sử dụng của tôm nguyên liệu ướp lạnh là ngắn (6 ngàyở nhiệt độ từ 5 –6oC), sản phẩm có pH cao (pH = 7,5) đây là điều kiện thuận lợi cho phép vi khuẩn Gram âm, trong đó có vi khuẩn Pseudomonas fragi và Shewanella putrefaciens phát triển một cách nhanh chóng trong điều kiện bảo quản hiếu khí [54].
Theo nghiên cứu của Matches (1982); Zuberi, Wood và Nottingham (1998); Lalitha và Surendran (2006) thì vi khuẩn Pseudomonas spp thường xuyên gây hư hỏng của tôm tươi ướp lạnh tạo mùi lưu huỳn h, gây hư hỏng cho sản phẩmtôm [61].
Chinivasagam và cộng sự (1996); Jeyasekaran và cộng sự (2006) đã phân lập vi khuẩn Gram âm như: Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Aeromonas, Vibrio, Shewanella, Alcaligenes, Flavobacterium, Coryneforms và Enterobactericeaelà những vi sinh vật thường xuyên nhất đ ược phân lập từ tôm nguyên liệu[36], [48].
Chinivasagam và cộng sự (1996) xác định rằng các loại tôm nhiệt đới bảo quản hiếu khí trong nước đá hoặc đá vụn bị hư hỏng do Pseudomonas fragi và Shewanella putrefaciens. Trong đóShewanella putrefaciens được cho là chiếm ưu thế khi bảo quản tôm bằng đá vụn với hàm lượng oxy thấp do khả năng sử dụng trimethylamineoxide (TMAO). Pseudomonas không sử dụng TMAO và tăng trưởng của nó bị ức chế trong môi trường có nồng độ O2 thấp (Ngo và Mackey, 1992) [61], [36].
Jeyasekaran và cộng sự (2006) đã xác định Pseudomonas spp và Aeromonas là vi sinh vật gây hư hỏng chính của tôm thẻ chân trắng Ấn Độ được bảo quản bằng đá. Những khác biệt trong các thành phần của hệ vi sinh vật bị hư hỏng là do môi trường CO2 được tạo ra bởi đá khô,Pseudomonas spp và Aeromonas nhạy cảm đối với khí này hơn so với Flavobacterium [49].
Trên cơ sở đó, Bonilla và cộng sự (2007) đã tiến hành xây dựng mối tương quan giữa chỉ số chất lượng và thời gian bảo quản bằng đá, dựa trên kết quả phân tích mật số vi sinh vật sinh ra H2S. Từ đó đánh giá được độ tươi của sản phẩm cá tuyết phi lê [31].
Shewanella putrefaciens còn được tìm thấy trong sản phẩm tôm. Khi cá mới đánh bắt mật số Shewanella putrefaciens rất nhỏ, nhưng trong quá trình bảo quản vi khuẩn này trở nên thích nghi với môi trường và phát triển mạnh mẽ, mật số tăng đến 107− 109 cfu/g (Jorgensen và cộng sự, 1988; Shewan, 1977). Do đó Shewanella putrefaciens cònđược sử dụng để tiên đoán vòngđời của sản phẩm thông qua kiểm tra mật số vi khuẩn này (Gram và Dalgaard, 2002) [51], [73], [37].
Reilly, Dangle và Cruz (1986) dựa trên việc đánh giá cảm quan thấy rằng tôm sú của Philippin bảo quản ở các nhiệt độ 0 oC, 5 oC và 10 oC có thể giữ được chất lượng để làm thực phẩm cho người trong thời gian tương ứng là 16, 11,5 và 6,5 ngày [67].
Năm 1995, Yamagata và Low đã nghiên cứu bảo quản tôm bạc (Penaeus merguiensis) trong nước đá và trong điều kiện đông lạnh. Các chỉ tiêu đánh giá độ tươi là TMAO, TMA, TVB-N và cảm quan. Kết quả cho thấy tôm có thể bảo quản được 4 ngày trong nước đá, 6 ngàyở nhiệt độ - 3 oC, 9 tuần ở nhiệt độ - 10 oC, và chất lượng của tôm vẫn còn rất tốt sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ-20oC [87].
Năm 1988, kết quả nghiên cứu của Fatima và cộng sự cho thấy tôm bạc
(Penaeus merguiensis) bảo quản ở nhiệt độ - 3 oC rất ít biến đổi về mặt sinh hóa, không có biến đổi đáng kể về số lượng vi sinh vật đến tận ngày bảo quản thứ 20. Trong khi đó tôm bảo quản ở nhiệt độ 0 oC có các biến đổi chất lượng rất rõ rệt, chất lượng tôm bảo quản ở nhiệt độ này chỉ tốt trong vòng 8 ngày đầu tiên so với 16 ngày của tôm bảo quản ở - 3oC [40].
Theo nghiên cứu của Mawlah (1975), xác định tổng nitơ bay hơi đối với
tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) bảo quản bằng nước đá vụn, kết
quả cho thấy lượng nitơ bay hơi tăng từ từ trong thời gian 7 ngày bảo quản đầu và sau đó biến đổi không theo quy luật, và cũng theo tác giả sự thối rữa của tôm nguyên liệu có thể phát hiện bằng phương pháp cảm quan vào ngày bảo quản thứ 19 –20 [62].
Năm 1981, Angel và cộng sự nghiên cứu đánh giá chất lượng tôm càng
xanh (Macrobracchium rosenbergii) bảo quản trong nước đá ở nhiệt độ 0 oC. Kết quả thực nghiệm cho thấy tôm duy trì chất lượng tốt trong 7 ngày. Tổng nitơ bay hơi sau 14 ngày bảo quản là: 31 mg/kg [29].
Nguyên liệu cá tươi có thể bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường nuôi, khi khảo sát điều kiện nuôi thâm canh cá lóc ở An Giang và Đồng Tháp đã phát hiện một lượng Aeromonas (54,3 %) và Pseudomonas (13,6 %) trên cá (Phạm Minh Đức và cộng sự, 2012) [10].
Cá ướp lạnh có thể bị thối do các vi khuẩn hiếu khí ưa lạnh gây ra đó là:
Pseudomonas fluorescens, Bacterium putrificiens,ngoài ra còn có sự phát triển khá mạnh của các loài nấm mốc. Ở cá đông lạnh, phần lớn các vi sinh vật bị ức chế, tuy nhiên phải lưu ý đến các vi sinh vật vẫn sống trong điều kiện tiềm sinh. Theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Thành và cộng sự thì trong quá trình sản xuất sản phẩm, cá có thể bị nhiễm một số loài vi sinh vật từ dụng cụ chứa, từ môi trường như: Pseudomonas [22].
Như vậy,có thể thấy đã có nhiều nghiên cứu ngoài nước về vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh cho người từ sản phẩm thủy sản nói chung, có ít nghiên cứu về vi sinh vật gây hỏng và gây bệnh cho người từ sản phẩm tôm sú bảo quản lạnh nói riêng. Trong nước hiện chưa có nghiên cứu nào về vi sinh vật gây hỏng và gây bệnh cho người từ sản phẩm tôm sú bảo quản lạnh. Vì vậy tiến hành đề tài nghiên cứu sự biến đổi của vi sinh vật gây hỏng và gây bệnh cho người từ sản phẩm tôm sú trong bảo quản lạnh nhằm tìm ra dữ liệu khoa học để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo là cần thiết và có ý nghĩa.
CHƯƠNG2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 . Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1 .Đối tượng nghiên cứu
Tôm sú (Penaeus monodon) sử dụng trong thí nghiệm được thu mua từ các đìa nuôi tại Khánh Hòa và BìnhĐịnh, cỡ 30 – 40 con/kg, tôm được ướp các lớp nước đá luân phiên trong thùng xốp và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang, thời gian vận chuyển khoảng 1 - 1,5 giờ (Khánh Hòa), 4 - 5 giờ (BìnhĐịnh). Tại phòng thí nghiệm, tôm được kiểm tra nhiệt độ và chất lượng, tất cả mẫu đều còn tươi. Tôm được rửa bằng nước lạnh (0–4oC), để ráo, xếp khay xốp, bọc bằng màng co PE và bảo quản lạnh ở điều kiệnnghiên cứu.
Hình 2.1.Tôm sú nuôi nguyên liệu thu mua từ BìnhĐịnh
2.1.2 . Hóa chất, môi trường
Hóa chất sử dụng để làm thí nghiệm là các hóa chất đạt yêu cầu dùng trong thí nghiệm và nghiên cứu khoa học: Acid trichloroacetic (Merck), acid boric
(Trung Quốc), Sodium hydroxide (Trung Quốc), Formaldehyde solution (Merck), EMB agar (Merck), Lauryl sulfate broth (Merck), Glycerol (Trung Quốc), Plate count agar (Merck), Pseudomonas agar F (Merck), Iron agar (Merck), Pepton from meat (Merck), Phenol red (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc), KH2PO4 (Trung Quốc), Pepton from casein (Merck),…
2.1.3 . Thiết bị, dụng cụ
Trong quá trình làm thí nghiệm đã sử dụng các loại thiết bị, dụng cụ sau:
- Thiết bị: Bộ chưng cất đạm, bộ chuẩn độ (buret), cân phân tích, micropipet, tủ sấy, nồihấp, tủ lạnh, tủ ủ ấm, tủ cấy, bếp từ,…
- Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình tam giác, bìnhđịnh mức,ống đong, đũa thủy tinh, phễu, lọ thủy tinh…
2.2 .Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 .Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu
Phương pháp thu mẫu: Mẫu tôm sú được thu từ các đìa nuôi ở Khánh Hòa và Bình Định. Sau đó được ướp các lớp nước đá trong thùng xốp và vận chuyển về phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang.
Phương pháp xử lý mẫu: Tại phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang tôm sú được rửa 3 lần bằng nước lạnh (0 - 4oC). Sau đó tôm sú được xếp khay xốp, bao màng PE, tiến hành bảo quản ở nhiệt độ ổn định (1 ± 1oC, 4 ± 1oC, 9 ± 1oC, 15 ± 1oC và 19 ± 1oC) và nhiệt độ biến động (nhiệt độ biến động 1 và nhiệt độ biến động 2). Tại những thời điểm nhất định tôm được lấy mẫu đánh giá cảm quan, phân tích hóa học và kiểm tra các chi tiêu vi sinh vật. Mỗi mẫu đánh giá cảm quan gồm 3 cá thể tôm sú (khoảng 100 g), sau khi đánh giá cảm quan xong mẫu được đem đi phân tích hóa học (kiểm tra hàm lượng TVB-N), mỗi mẫu kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật gồm 6 cá thể tôm sú (khoảng 200 g) được làm nhỏ và đồng nhất sau đó lấy 25 g mẫu tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình của 3 lần lặp lại.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Tôm sú nguyên liệu
Xử lý Bảo quản Nhiệt độ biến động Nhiệt độ cố định Lần 3 Lần 2 Lần 1 Số lần thí nghiệm Xác định các VSV ban đầu trên tôm sú
Kết quả, kết luận
Vi sinh vật Hóa học(TVB-N)
Cảm quan (QIM)
Thuyết minh: Mẫu tôm sú nguyên liệu được thu tại các đìa nuôiở Khánh Hòa và BìnhĐịnh sau đó được ướp các lớp nước đá và vận chuyển về đến phòng thí nghiệm – Đại học Nha Trang. Tôm sú được rửa bằng nước lạnh (0 - 4 oC) sau đó tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ban đầu
(TVC, Coliform, E.coli, S.aureus, Salmonella, Vibrio, Listeria monocytogenes, Pseudomonas spp, vi khuẩn sinh H2S). Tiếp theo tôm sú được xếp khay xốp bao màng PE và bảo quản ở các nhiệt độ ổn định (1 ± 1oC, 4 ± 1oC, 9 ± 1oC, 15 ± 1oC và 19 ± 1oC) và nhiệt độ biến động (nhiệt độ biến động 1 và nhiệt độ biến động 2). Ở mỗi chế độ bảo quản, tại những thời điểm nhất định tôm được lấy mẫu đánh giá cảm quan, phân tích hóa học và kiểm tra các chi tiêu vi sinh vật.
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các vi sinh vật ban đầu trên tôm sú
Thuyết minh: Mẫu tôm sú nguyên liệu được thu tại các đìa nuôi ở Khánh Hòa và Bình Định sau đó được ướp các lớp nước đá và vận chuyển về đến phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Tôm sú được rửa bằng nước lạnh (0 - 4 oC) sau đó tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ban đầu
(TVC, Coliform, E.coli, S.aureus, Salmonella, Vibrio, Listeria monocytogenes, Pseudomonas spp, vi khuẩn sinh H2S). Nhằm đánh giá mật độ vi sinh vật trên đối tượng nghiên cứu và làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định các vi sinh vật ban đầu trên tôm sú Xác địnhvi khuẩn sinh H2S Xác định TVC Xác định Salmo -nella Xác định Listeria monocyt o-genes Xác định Pseudo - monas spp Xác định Vibrio Xác định E.coli Xác địnhS. aureus Xác định Colifor m
Tôm sú nguyên liệu
Xử lý
Xác định các vi sinh vật
ban đầu trên nguyên liệu
Kết quả
Thảo luận
2.2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ổn định
a/ Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản tôm sú ở các nhiệt độ ổnđịnh định
Mục đích: Khảo sát khoảng thời gian bảo quản tôm sú tại các nhiệt độ ổn định.
Hình 2.4.Sơ đồbố tríthí nghiệm khảo sátthời gian bảo quản tôm sú ởcác nhiệt độ ổn định
Ngày bảo quản thứ 0; 0,2; 0,3; 0,5; 0,8; 1; 1,3 Tôm sú nguyên liệu
Xử lý
Ngày bảo quản thứ 0; 4; 6; 7; 8; 9; 11
Ngày bảo quản thứ 0; 0,9; 1,3; 1,9; 2,1; 2,3,2,8 Ngày bảo quản thứ
0; 1; 2; 3; 4; 5; 6
Ngày bảo quản thứ 0,;2; 3; 4; 5; 6; 7 Kết quả, kết luận Vi sinh vật Hóa học(TVB-N) Đánh giá chất lượng 1 ± 1oC 4 ± 1oC 9 ± 1oC 15 ± 1oC 19± 1oC
Tôm sú nguyên liệu được bảo quản trong tủ lạnh có gắn thiết bị điều chỉnh được nhiệt độ,ở 5 chế độnhiệt độ ổn định là: 1 ± 1oC, 4 ± 1 oC, 9 ± 1 oC, 15 ± 1oC và 19 ± 1 oC. Ở mỗi chế độ bảo quản, tại những thời điểm nhất định tôm được lấy mẫu phân tích hóa học và kiểm tra các chi tiêu vi sinh vật.
b/ Bố trí thí nghiệm bảo quản tôm sú ở các nhiệt độ ổn định
Mục đích: Theo dõi sự biến đổi về cảm quan, lượng TVB-N, vi sinh vật tổng số, các vi sinh vật gây hỏng đặc trưng (vi khuẩn sinh H2S, Pseudomonas
spp) và các vi sinh vật gây bệnh (Coliform, E.coli) trong quá trình bảo quản ở các chế độ nhiệt độ ổn định.
Tôm sú được bảo quản trong tủ lạnh có gắn thiết bị điều chỉnh được nhiệt độ. Ở 5 chế độ nhiệt độ ổn định là: 1 ± 1oC, 4 ± 1oC, 9 ± 1oC, 15 ± 1 oC và 19 ± 1 oC. Khoảng thời gian bảo quản được xác định từ thí nghiệm khảo sát bên trên. Ở mỗi chế độ bảo quản, tại những thời điểm nhất định tôm được lấy mẫu để đánh giá cảm quan, phân tích hóa học và kiểm tra các chi tiêu vi sinh vật.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm bảo quản tôm sú ở các nhiệt độ ổn định
2.2.2.4 . Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ biến động
Tôm sú nguyên liệu
Xử lý
Số lần thí nghiệm
Lần 1 Lần 2
Ngày bảo quản thứ 0; 2; 4; 6; 8; 9; 10
Ngày bảo quản thứ 0; 0,4; 0,6; 1; 1,3; 1,6; 2
Ngày bảo quản thứ
0; 0,3; 0,5; 0,6; 0,8; 0,9; 1 2,8
Ngày bảo quản thứ 0; 1,2; 1,5; 2; 2,5; 2,8; 3
Ngày bảo quản thứ 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6 Kết quả, kết luận Vi sinh vật Hóa học (TVB-N) Cảm quan(QIM) Đánh giá chất lượng 1 ± 1oC 4 ± 1oC 9 ± 1oC 15 ± 1oC 19 ± 1oC
a/ Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản tôm sú ở các nhiệt độ
biến động
Mục đích: Khảo sát khoảng thời gian bảo quản tôm sú tại các chế độ nhiệt độ biến động.
Hình 2.6.Sơ đồ bố trí thí nghiệmkhảo sátthời gian bảo quản tôm sú ở các
Ngày bảo quản thứ 0; 1; 2; 2,1; 2,3; 2,5; 2,8 Ngày bảo quản thứ
0; 2; 2,1; 2,3; 2,7; 3; 3,3
Biến động 1
Tôm sú nguyên liệu
Xử lý
Bảo quản tại các nhiệt độ biến động
Biến động 2 Kết quả Thảo luận Kết luận Vi sinh vật Hóa học (TVB-N) Đánh giá chất lượng
b/Bố trí thí nghiệm bảo quản tôm sú ở các nhiệt độ biến động
Hình 2.7.Sơ đồ bố trí thí nghiệm bảo quản tôm sú ở các nhiệt độ biến động
Mục đích: Theo dõi sự biến đổi về cảm quan, hàm lượng TVB-N, vi sinh vật tổng số, các vi sinh vật gây hỏng đặc trưng (vi khuẩn sinh H2S,
Tôm sú nguyên liệu
Xử lý
Số lần thí nghiệm
Lần 1 Lần 2
Bảo quản tại các nhiệt độ biến động
Ngày bảo quản thứ 0; 1; 2; 2,1; 2,3; 2,4; 2,5 Ngày bảo quản thứ
0; 2; 2,1; 2,3; 2,7; 2,75; 2,83 Biến động 1 Biến động 2 Kết quả, kết luận Visinh vật Hóa học (TVB-N) Cảm quan (QIM) Đánh giá chất lượng
Pseudomonas spp) và các vi sinh vật gây bệnh (Coliform, E.coli) trong quá trình bảo quản.
Tôm sú được bảo quản ở2 chế độ nhiệt độ biến động là:
- Biến động 1: bảo quản ở chế độ 1 ± 1 oC trong 48 giờ, nhiệt độ môi trường (30 - 32 oC) trong 2 giờ và ở chế độ 9 ± 1 oC cho đến khi tôm hỏng. Mô phỏng việc tôm được bảo quản và bày bán tại siêu thị, sau đó được người tiêu dùng mua, vận chuyển về và cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh dân dụng.
- Biến động 2: bảo quản bằng nước đátrong thùng xốp (nhiệt độ bên ngoài thùng 50-55oC) trong 24 giờ, bảo quản ở chế độ1 ± 1oC trong 24 giờ, nhiệt độ môi trường (30-32 oC) trong 2 giờ vàở chế độ 9±1 oC cho đến khi tôm hỏng. Chế độ này mô phỏng việc tôm được vận chuyển từ các vùng nuôi xa (Sóc Trăng,Cà Mau, …) về Nha Trang trong các hầm chứa đồ của xe vận chuyển dân dụng, sau đó được người tiêu dùng mua, vận chuyển về và cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh dân dụng.
Khoảng thời gian bảo quản được xác định từ thí nghiệm khảo sát bên trên. Ở mỗi chế độ bảo quản, tại những thời điểm nhất định tôm được lấy mẫu để