Kỹ thuật xử lý mẫu bệnh phẩm:
Lấy bệnh phẩm (máu cho vào chai cấy máu của hãng Bactec; DNT).
Đưa bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm vi nấm của BV Bệnh Nhiệt Đới (xử lý ngay trong vòng 1 h).
Nếu bệnh phẩm là máu thì cho chai cấy máu vào máy CM, mẫu dương tính thì tiến hành đem soi và cấy.
Nếu bệnh phẩm là DNT, tiến hành ly tâm sau đó soi và cấy để phát hiện vi nấm.
Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên vỏ của Cryptococcus neoformans bằng phản ứng ngưng kết hạt Latex.
Nguyên tắc
Vỏ polysaccharide của Cryptococcus neoformans được cấu tạo bởi thành phần chính là glycronoxymannan (gmx). Cấu trúc kháng gmx được gắn vào trong hạt latex. Kết quả của sự ngưng kết giữa cấu trúc gmx và thành phần kháng gmx sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường. Phản ứng có ý nghĩa khi ta sử dụng ít nhất 50 ng/ml huyết thanh hoặc DNT.
Cách tiến hành
Tiến hành xử lý mẫu:
Pha enzyme pronase đông khô với 1 ml nước cất vô trùng. Tránh tạo bọt trong suốt quá trình pha loãng và đảm bảo hòa tan hoàn toàn. Nếu mẫu nhiều 30 - 40 test mỗi tháng thì lưu giữ ở 2 - 8 0C. Còn nếu ít mẫu, pha thành ống nhỏ 20 µl và giữ ở 200
C.
a/ Mẫu huyết thanh
+ Hút 120 µl bệnh phẩm vào một tube chứa nắp đậy chặt và thêm vào 20 µl enzyme pronase.
+ Lắc trộn mạnh và làm nóng tới 560C trong 30 phút trong bể hấp cách thủy.
+ Lấy ống ra và thêm vào 1 giọt dung dịch dừng phản ứng.Trộn đều hoàn toàn.
b/ Mẫu dịch não tủy
+ Nếu dịch não tủy quá đục hay chứa nhiều hồng cầu, ly tâm trong 5 phút (2000 vòng/phút) và thu lượm dịch nổi.
+ Xử lý giống như mẫu huyết thanh.
+ Dừng phản ứng hoạt động của enzyme pronase bằng cách đun nóng tới 1000C trong bể cách thủy trong 5 phút. Trộn đều hoàn toàn.
+ Để nguội 3 - 4 phút trước khi bắt đầu ngừng ngưng kết.
Chú ý: khi sử dụng bể hấp thủy không cho nước vào trong tube để tránh kết quả sai lệch.
Thực hiện phản ứng ngưng kết:
Cho 40 µl bệnh phẩm đã xử lý lên vòng tròn của phiến làm ngưng kết. Cạnh đó thêm vào một giọt Cryptococcus latex.
Sử dụng thanh que trộn đều.
Thực hiện phép đối chứng âm bằng cách trộn lẫn 40 µl đệm pha với 1 giọt latex.
Đặt phiến lên máy lắc trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 18 - 300C.
Latex Cryptococcus: nhỏ 1 giọt trong chai Cryptococcus latex (1 ml) lên phiến kèm theo sản phẩm. Lấy một ít bệnh phẩm hay khuẩn lạc nuôi cấy từ bệnh
phẩm cho vào trong giọt dung dịch vừa nhỏ. Cầm phiến lên và lắc đều trong 5 phút.
Yêu cầu kết quả
Nếu có sự ngưng kết: dung dịch ban đầu từ màu đỏ tươi chuyển sang đỏ thẫm cùng các hạt lớn mà mắt thường có thể nhìn thấy thì đây chính bệnh phẩm có Cryptococcus neoformans. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấy máu
Nguyên tắc hoạt động
Trong môi trường cấy, khi có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu, chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất, thải khí carbon dioxide (CO2) vào môi trường. Lượng CO2 này phản ứng với một chất nhuộm được gắn trong bộ phận cảm biến ở mỗi đáy chai và phát ra ánh sáng. Mẫu dương tính được báo hiệu ngay bằng nguồn ánh sáng chỉ thị nằm phía trước máy và đèn báo, vị trí mẫu dương tính được hiển thị trên màn hình LCD. Sau đó, lấy mẫu dương tính ra khỏi máy, tiến hành nhuộm Gram, phân lập và định danh vi sinh vật.
Cách tiến hành
Máu lấy từ bệnh nhân được tiêm trực tiếp vào chai cấy. Trẻ em sử dụng chai có dung tích 1 - 3 ml, người lớn 8 - 10 ml.
Đánh số thứ tự của chai. Đưa vào trong máy.
Theo dõi sự hiển thị thông báo của máy khi phát hiện ra trong máu có sự hiện diện của vi sinh vật (mẫu dương tính).
Yêu cầu kết quả
Phát hiện được các chai cấy máu dương tính.
Soi tươi bệnh phẩm bằng mực Tàu
Sử dụng cho bệnh phẩm: dịch não tủy.
Nguyên tắc
Tạo một nền tối của mực tàu để làm nổi rõ lớp vỏ nhầy trong suốt bao quanh tế bào sinh vật.
Cách tiến hành
Đem ly tâm dịch não tủy ở 10000 vòng trong 4 phút. Sau đó lấy phần cặn để phết mực tàu.
Nhỏ 1 giọt mực tàu lên lam kính.
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc nấm. Đặt mẫu nấm lên thuốc nhuộm.
Dùng que cấy trộn đều.
Đem soi ở vật kính x40 và rút ra kết luận.
Yêu cầu kết quả
Nếu bệnh nhân bị nhiễm Cryptococcus neoformans, ta sẽ thấy các tế bào hạt men có vùng sáng bao xung quanh. Vùng sáng này là bao nang, phân biệt rõ trên nền tối sẫm của lam kính do thấm mực Tàu.
Phản ứng urê dương tính
Nguyên tắc hoạt động
Cryptococcus neoformans cho phản ứng dương tính với urê, làm môi trường urê chuyển sang màu hồng sau ít giờ dùng để phân biệt Cryptococcus neoformans với tế bào nấm men khác.
Cách tiến hành
Lấy khuẩn lạc của vi nấm Cryptococcus neoformans trên MT1 sau khi đã quan sát trên kính hiển vi cho vào môi trường thạch nghiêng urê.
Yêu cầu kết quả
Nếu sau vài giờ màu thạch nghiêng nào chuyển sang màu hồng ta kết luận là Cryptococcus neoformans.
Kỹ thuật cấy phân lập vi nấm Cryptococcus neoformans trên MT1
Với các mẫu đem soi ta chỉ có thể kết luận rằng mẫu có chứa nấm hay không. Để định danh chính xác tên vi nấm ta phải cấy lên MT1 để phân lập trước. Khi có khuẩn lạc mọc trên môi trường ta mới sử dụng các kỹ thuật định danh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc
Tách rời các tế bào vi nấm.
Nuôi các tế bào vi nấm trên môi trường 1 – môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
Cách tiến hành
Ghi tên bệnh nhân, mẫu bệnh phẩm, ngày cấy lên phía ngoài của đĩa thạch.
Dùng que cấy vòng lấy một ít bệnh phẩm. Sau đó dùng kỹ thuật ria chữ T lên trên mặt thạch. Đậy hộp petri lại, ủ trong nhiệt độ 250C. Sau 24 giờ, quan sát sự hình thành khuẩn lạc.
Yêu cầu kết quả
Các khuẩn lạc hình thành riêng rẽ nhau.
Kỹ thuật soi khuẩn lạc nấm sau khi cấy bằng lacto phenol cotton blue (LPCB)
Nguyên tắc: thuốc nhuộm giết các vi nấm, giúp quan sát vi nấm tốt hơn.
Cách tiến hành
Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm LPCB lên lam kính.
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc nấm, nếu là khuẩn lạc của nấm men thì chỉ cần chạm nhẹ đầu que cấy xuống khuẩn lạc vào trong thạch.
Đặt mẫu nấm lên thuốc nhuộm. Dùng que cấy trộn đều.
Đậy lamen lên và quan sát trên kính hiển vi và rút ra kết luận.
Yêu cầu kết quả
Khuẩn lạc là nấm men, quan sát tìm các tế bào nấm men và cách nảy chồi của chúng cùng với đo kích thước của tế bào.
Kỹ thuật định danh các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans.
Với các mẫu đem soi ta chỉ có thể kết luận rằng mẫu có chứa nấm hay không. Để định danh chính xác ta phải cấy lên môi trường Sabouraud trước. Khi có khuẩn lạc mọc trên môi trường ta mới sử dụng các phương pháp định danh như sau:
Hình 2.2. Sơ đồ định danh vi nấm Cryptococcus neoformans
Kỹ thuật định danh các chủng Cryptococcus neoformans trên
môi trường MT4
• Nguyên tắc
Sau khi soi và nuôi cấy trên MT1 xác định là Cryptococcus neoformans. Để định danh chính xác tên chủng vi nấm Cryptococcus neoformans, ta phải tiến hành thực hiện trên MT4. Dựa vào khả năng khả năng kháng canavanine và sử dụng glycine như nguồn carbon trong môi trường canavanine glycine bromothymol blue (CGB) để phân biệt Cryptococcus neoformans var neoformans.và Cryptococcus neoformans var gattii. Cryptococcus neoformans var gattii tiêu thụ carbon sinh ra ammoniac là tăng pH môi trường, chất chỉ thị bromothymol blue. Do đó, sẽ chuyển qua màu kiềm dẫn đến sử biến đổi màu
Loại
vàng của thạch thành màu xanh dương. Trong khi đó Cryptococcus neoformans var neoformansnhạy cảm với canavanine, đồng thời không sử dụng glycine nên không phát triển trên CGB và không là thay đổi màu canh cấy.
• Cách tiến hành
Ghi tên bệnh nhân, mẫu bệnh phẩm, ngày cấy lên phía ngoài của đĩa thạch. Dùng que cấy lấy một ít vi nấm Cryptococcus neoformans đã được ủ sau 2 - 3 ngày trên MT1 dàn đều trên mặt MT4.
Đậy hộp petri lại, ủ trong nhiệt độ 250C.
Sau 24 - 48 giờ quan sát sự hình thành màu sắc của khuẩn lạc Cryptococcus neoformans. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Yêu cầu kết quả
+ Cryptococcus neoformans var neoformans:không làm đổi màu MT4.
+ Cryptococcus neoformans var gattii: làm MT4 chuyển sang màu xanh dương.
Kỹ thuật định danh các kiểu huyết thanh Cryptococcus
neoformans trên môi trường MT5
• Nguyên tắc
Đối với chủng Cryptococcus neoformans var neoformans để định danh chính xác tên các kiểu huyết thanh, ta phải tiến hành thực hiện trên MT5.
• Cách tiến hành
Sau khi đã định danh được chủng Cryptococcus neoformans var neoformans.Ghi tên bệnh nhân, mẫu bệnh phẩm, ngày cấy lên phía ngoài của đĩa thạch.
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc Cryptococcus neoformans var neoformansđã được ủ sau 2 ngày từ MT1 dàn đều trên mặt MT5.
Sau 5 ngày cấy trên môi trường CDBT, ủ ở 28o
C và xem kết quả. • Yêu cầu kết quả
Serotype D phát triển thành khúm màu đỏ sáng và làm đổi màu từ vàng thành cam sáng. Trong khi đó, khúm serotype A có màu tái và môi trường vẫn giữ nguyên màu nguyên thủy.
Kháng nấm đồ
Lí do thực hiện kháng nấm đồ
Khảo sát độ nhạy cảm của vi nấm Cryptococcus neoformans với các thuốc kháng nấm đang sử dụng để làm cơ sở lựa chọn thuốc điều trị hiệu quả nhất.
Cách thử độ nhạy cảm của thuốc kháng nấm
Dựa vào tác động của thuốc với vi nấm. Nếu thuốc đó nhạy cảm với
Cryptococcus neoformans thì sẽ hình thành vòng vô khuẩn. Vòng càng rộng ảnh hưởng của thuốc đối vi nấm càng mạnh. Nếu không có vòng hay vòng yếu thì thuốc không có tác dụng (hay tác dụng không đáng kể).
• Phương pháp :
Dùng que cấy lấy một ít vi nấm đã mọc trên môi trường Sabouraud (MT1) khoảng 48 giờ.
Pha loãng với nước cất vô trùng đạt được nồng độ 0,5 McF.
Dùng pipet nhỏ dịch nấm vào MT1, dàn đều dịch nấm men bề mặt MT1. Dùng kẹp đặt các đĩa thuốc kháng nấm vào.
Ủ trong 24 giờ.
Đo đường kính của vòng vô khuẩn và rút ra kết luận. • Yêu cầu kết quả:
Nếu vi nấm kháng thuốc sẽ không hình thành vòng vô khuẩn. Nếu vi nấm nhạy cảm với thuốc sẽ hình thành vòng vô khuẩn. Vòng càng rộng, khả năng nhạy cảm của vi nấm với thuốc càng cao.
Kỹ thuật bảo quản các chủng vi nấmCryptococcus neoformans
Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng
dung dịch BHI - glyxerol (ở nhiệt độ - 200
C). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Nguyên tắc
Ở nhiệt độ - 200C, các vi nấm Cryptococcus neoformans sẽ bị ức chế các hoạt động sống. Vì thế thời gian lưu giữ mẫu sẽ được lâu hơn.
• Cách tiến hành
Dùng que cấy phết nhẹ vào khuẩn lạc nấm. Hòa vào lọ chứa dung dịch BHI - glyxerol.
Dùng parafin quấn quanh miệng nắp chai cho kín.
Ghi chú tên bệnh nhân, bệnh phẩm, ngày giữ mẫu, tên vi nấm. Lưu mẫu vào tủ lạnh ở - 200 C.
• Yêu cầu kết quả
Đảm bảo mẫu bảo quản phải vô trùng, không bị tạp nhiễm.
Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng
nước cất (ở nhiệt độ thường).
• Nguyên tắc
Vi nấm có thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt.
• Cách tiến hành
Dùng que cấy phết nhẹ vào khuẩn lạc nấm. Hòa vào lọ chứa nước cất vô trùng.
Ghi chú tên bệnh nhân, bệnh phẩm, ngày giữ mẫu, tên vi nấm. Lưu mẫu tại phòng thí nghiệm.
• Yêu cầu kết quả
Đảm bảo mẫu bảo quản phải vô trùng, không bị tạp nhiễm.
Hình 2.3. Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng dung dịch BHI.
Hình 2.4. Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng nước cất.
Chương III - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN