3.3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh cầu trùng bê, nghé ở 3 xã của huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng ở bê, nghé tại 3 xã của huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên.
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi bê, nghé.
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng ở bê, nghé theo mùa vụ.
- Xác định sự ô nhiễm Oocyst cầu trùng bê, nghé ở chuồng trại và khu vực xung quanh chuồng nuôi.
- Xác định sự ô nhiễm Oocyst cầu trùng bê, nghé ở chuồng trại và khu vực xung quanh chuồng nuôi.
3.3.3. Nghiên cứu vai trò của cầu trùng trong hội chứng tiêu chảy và triệu chứng lâm sàng của bệnh cầu trùng bê, nghé. triệu chứng lâm sàng của bệnh cầu trùng bê, nghé.
- Vai trò của cầu trùng trong hội chứng tiêu chảy bê, nghé tại 3 xã của huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên.
- Nghiên cứu biểu hiện lâm sàng của bê nghé bị bệnh cầu trùng.
3.3.4. Nghiên cứu biện pháp phòng, trị cầu trùng cho bê, nghé.
- Xác định công thức ủ phân nhiệt sinh học có khả năng sinh nhiệt tốt để diệt Oocyst cầu trùng bê, nghé.
- Nghiên cứu tác dụng của thuốc trị cầu trùng bê, nghé.
- Bước đầu đề xuất quy trình phòng, trị bệnh cầu trùng cho bê, nghé.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp xác định loài cầu trùng ký sinh ở bê, nghé của huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên
* Phương pháp thu nhận Oocyst
- Thu nhận Oocyst từ mẫu phân bê, nghé nhiễm nặng bằng phương pháp Darling, vớt Oocyst đưa vào nước sạch rồi ly tâm lấy cặn.
Cách tiến hành: Cho 5 -10g phân hòa tan với nước lã, lọc qua lưới thép rồi quay ly tâm nước lọc khoảng 3 phút. Khi đó, tỷ trọng của Oocyst nặng hơn tỷ trọng của nước lã sẽ lắng xuống đáy, đổ từ từ nước ở trên rồi cho dung dịch nước muối bão hòa vào, dung đũa thủy tinh khuấy tan cặn, ly tâm lần nữa trong 3 phút, lúc này trứng sẽ nổi lên trên. Lấy vòng thép vớt màng nổi lên trên phiến kính, soi kính hiển vi tìm Oocyst cầu trùng.
* Phương pháp nuôi Oocyst thành Oocyst có sức gây bệnh
Oocyst cầu trùng được nuôi trong dung dịch Bichromat kali 2,5%, có lắc đảo thường xuyên để phát triển thành Oocyst có sức gây bệnh.
Hàng ngày dùng công tơ hút (φ = 2 - 3 mm) lấy dung dịch Bichromat kali 2,5% có chứa Oocyst, soi kính, ghi lại sự biến đổi hình thái và cấu trúc của Oocyst. Từ đó, xác định được thời gian phát triển của Oocyst thành
Oocyst gây bệnh trong môi trường Bichromat kali 2,5%.
* Phương pháp định danh loài cầu trùng ký sinh ở bê, nghé
Loài cầu trùng ký sinh ở bê nghé nuôi tại huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên được định danh theo khóa đinh loại của Levine N. D. (1985) [41] dựa trên 2 căn cứ:
- Hình thái, kích thước của Oocyst và cấu tạo của Oocyst có sức gây bệnh. - Thời gian Oocyst phát triển thành Oocyst có sức gây bệnh.
Dùng trắc vi thị kính đo kích thước của Oocyst cầu trùng dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần, ghi lại hình ảnh Oocyst dưới kính hiển vi.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu một sốđặc điểm dịch tễ bệnh cầu trùng bê nghé
3.4.2.1. Phương pháp thu thập, xét nghiệm mẫu * Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu phân: Lấy mẫu phân mới thải ra của bê, nghé. Cho mỗi mẫu vào một túi nilông riêng, ghi nhãn (thời gian lấy mẫu; địa điểm; tuổi bê , nghé…).
- Mẫu cặn nền chuồng: tại mỗi chuồng nuôi của bê, nghé, lấy mẫu cặn ở 4 góc và ở giữa chuồng, trộn đều được một mẫu xét nghiệm. Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon có nhãn ghi địa điểm và thời gian lấy mẫu.
- Mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuôi : trong khoảng cách 5m xung quanh chuồng bê nghé, cứ 10 - 15m2 lấy 1 mẫu đất bề mặt (15 - 20g/mẫu, được phối hợp bởi 4 mẫu ở 4 góc và 1 mẫu ở giữa).
Các mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày, những mẫu chưa xét nghiệm bảo quản ở nhiệt độ 20C - 40C, không quá 3 ngày.
* Phương pháp xét nghiệm mẫu
Mẫu phân được xét nghiệm bằng phương pháp phù nổi Fulleborn để phát hiện Oocyst cầu trùng.
Sử dụng phương pháp phù nổi Fullerborn
+ Nguyên lý: Lợi dụng tỷ trọng của dung dịch bão hòa lớn hơn tỷ trọng của Oocyst cầu trùng, khi đó Oocyst sẽ nổi lên trên bề mặt dung dịch. + Cách tiến hành: Lấy 5-10 gam phân cho vào cốc thủy tinh, dùng đũa thủy tinh nghiền nát, vừa nghiền vừa đổ 50-60ml nước muối bão hòa vào, sau đó lọc qua lưới lọc để loại cặn bã thô, lấy nước lọc cho vào lọ nhỏ sao cho đầy lên đến miệng, đặt phiến kính lên miệng lọ sao cho tiếp xúc với nước lọc, để yên 15 phút rồi lấy phiến kính ra soi.
Mẫu cặn nền chuồng và mẫu đắt xung quanh chuồng nuôi được xét nghiệm bằng phương pháp Darling để phát hiện cầu trùng.
3.4.2.2. Phương pháp xác định một số yếu tố liên quan đến đặc điểm dịch tễ bệnh cầu trùng ở bê, nghé
* Lứa tuổi bê nghé: Bê nghé nghiên cứu được phân thành 4 lứa tuổi:
-Sơ sinh - 2 tháng tuổi
- > 2 - 4 tháng tuổi
- > 4 - 8 tháng tuổi
* Theo dõi theo các tháng trong thời gian thực tập: từ tháng 6 đến tháng 11 năm 2013.
3.4.2.3. Phương pháp xác định bê, nghé nhiễm cầu trùng và cường độ nhiễm
* Xác định bê nghé nhiễm cầu trùng: Tất cả các mẫu phân bê nghé đều được xét nghiệm bằng phương pháp phù nổi Fulleborn, phát hiện Oocyst
cầu trùng dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại x 100 và x 400). Mẫu phân của bê nghé phát hiện thấy Oocyst cầu trùng được đánh giá là bê nghé nhiễm cầu trùng.
* Xác định cường độ nhiễm cầu trùng: Cường độ nhiễm cầu trùng được xác định bằng số lượng Oocyst/gam phân.
* Phương pháp đếm trên buồng đếm Mc. Master
Lấy 2g phân, cho vào 58ml nước muối NaCl bão hòa. Khuấy đều, dùng pipet bơm vào buồng đếm Mc. Master (0,15ml/1 buồng). Sau khoảng 2 phút, đem soi dưới kính hiển vi và đếm số lượng Oocyst trong buồng đếm.
Số lượng Oocyst có trong 1g phân bằng:
( Tổng số Oocyst đếm được x 60) / Số lượng buồng
Căn cứ vào kết quả xét nghiệm và biểu hiện lâm sàng của bê, nghé quy định 4 mức cường độ nhiễm:
- ≤ 5.000 Oocyst/gam phân: cường độ nhiễm nhẹ
- > 5.000 - 10.000 Oocyst/gam phân: cường độ nhiễm trung bình
- > 10.000 - 15.000 Oocyst/gam phân: cường độ nhiễm nặng
- > 15.000 Oocyst/gam phân: cường độ nhiễm rất nặng
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của bệnh cầu trùng ở bê, nghé trùng ở bê, nghé
3.4.3.1. Xác định vai trò của cầu trùng trong hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên
∗ Phương pháp bố trí
+ Bình thường: Phân bê khỏe mạnh thường khô ráo, đóng thành các viên hay khuôn. Phân nghé khỏe mạnh thường nhão hơn phân bê, có thể hơi giống như phân trâu trưởng thành nhưng kích thước nhỏ hơn nhiều.
+ Tiêu chảy: Phân có dạng sền sệt hay loãng, có màu vàng hay xám, đen…mùi tanh hoặc thối khắm, đôi khi có lẫn màng nhày hoặc máu…có thể đặc trưng cho từng bệnh.
* Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng theo 2 trạng thái phân:
Xét nghiệm phân bằng phương pháp phù nổi Fulleborn để phát hiện
Oocyst cầu trùng; từ đó xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng ở hai trạng thái phân.
3.4.3.2. Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng chủ yếu của bê, nghé bị bệnh cầu trùng
Trong quá trình xét nghiệm phân, phát hiện được những bê, nghé nhiễm cầu trùng. Chọn những bê, nghé chỉ nhiễm cầu trùng, không nhiễm bất cứ loại giun sán và bệnh truyền nhiễm nào khác, theo dõi các biểu hiện lâm sàng của những bê, nghé này.
Sử dụng các phương pháp chẩn đoán lâm sàng như: đo thân nhiệt bằng nhiệt kế 430C, quan sát thể trạng, lông, da; quan sát màu sắc các niêm mạc; theo dõi màu sắc, trạng thái và mùi phân, số lần đi ỉa trong ngày; tình trạng ăn uống...
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu biện pháp phòng, trị cầu trùng cho bê, nghé
3.4.4.1. Phương pháp xác định công thức ủ nhiệt sinh học có khả năng sinh nhiệt tác động để diệt Oocyst cầu trùng bê, nghé
* Bố trí thí nghiệm xác định công thức ủ phân có khả năng sinh nhiệt tốt để diệt Oocyst cầu trùng
Thực hiện thí nghiệm với 3 công thức ủ, nhằm lựa chọn được một công thức có khả năng sinh nhiệt tốt nhất.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Chuẩn bị nguyên liệu ủ, bố trí ủ theo 3 công thức sau: + Công thức 1: Các nguyên liệu ủđược chuẩn bị theo tỷ lệ:
Phân chuồng: 800 - 1000 kg. Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. Tro bếp: 60 kg.
+ Công thức 2: Các nguyên liệu ủđược bố trí theo tỷ lệ: Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. Vôi bột: 50 kg.
+ Công thức 3: Các nguyên liệu ủđược bố trí theo tỷ lệ: Phân chuồng: 800 - 1000 kg.
Tro bếp: 60 kg.
Lá xanh băm nhỏ: 200 kg. Vôi bột: 50 kg.
- Cách ủ phân: Trộn đều các nguyên liệu theo tỷ lệ của mỗi công thức ủ, cho vào mỗi bao nilon 20 kg hỗn hợp nguyên liệu đã trộn của mỗi công thức trên.
Cũng trộn đều 5 kg phân của bê, nghé nhiễm cầu trùng nặng với các nguyên liệu khác (lá xanh băm nhỏ, tro bếp, vôi bột) theo tỷ lệ như 3 công thức, sau đó chia vào các túi vải nhỏ (mỗi túi 10 - 15 g), đặt vào trong các bao phân ủ (ở các vị trí khác nhau). Buộc miệng bao để tạo môi trường yếm khí trong bao.
* Phương pháp theo dõi khả năng sinh nhiệt và tác dụng diệt Oocyst của 3 công thức ủ
Hàng ngày dùng nhiệt kế 1000C đo nhiệt độ phân ủ, đồng thời lấy từ mỗi bao 1 túi vải để xét nghiệm Oocyst cầu trùng. Từ đó xác định
được khả năng sinh nhiệt của mỗi công thức ủ và tác dụng diệt Oocyst
cầu trùng bê, nghé.
3.4.4.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng điều trị của thuốc trị cầu trùng cho bê, nghé
* Phương pháp nghiên cứu lựa chọn thuốc
Lựa chọn các loại thuốc thường dùng đểđiều trị bệnh cầu trùng cho bê nghé. Dự kiến mỗi loại thuốc được dùng cho 10 bê nghé có cùng lứa tuổi, mức độ nhiễm và biểu hiện lâm sàng. Sau 5, 10, 15 ngày dùng thuốc, xét nghiệm phân kiểm tra số Oocyst/gam phân để đánh giá hiệu lực điều trị của từng loại thuốc. Từ đó, lựa chọn một thuốc có hiệu lực tẩy cao nhất và thời gian tẩy sạch Oocyst cầu trùng sớm nhất.
∗ Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc
- Phương pháp xác định khối lượng bê, nghé để tính liều lượng thuốc Dùng cân xác định khối lượng những bê, nghé nhỏ để tính liều lượng thuốc, với những bê, nghé có khối lượng lớn thì xác định khối lượng bằng cách đo và tính theo Tô Du (2004) [3] bằng công thức:
+ Nghé: KL (kg) = 88,4 x (vòng ngực)2 x dài thân chéo (m). + Bê: KL (kg) = 90 x (vòng ngực)2 x dài thân chéo (m).
- Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc trị cầu trùng bê, nghé Trước khi dùng thuốc, xác định cường độ nhiễm bằng cách đếm số lượng Oocyst/gam phân. Sau khi dùng thuốc 15 ngày, xác định hiệu lực thuốc bằng phương pháp xét nghiệm lại phân bê, nghé tìm Oocyst và đếm số Oocyst/gam phân. Nếu không thấy Oocyst trong phân thì đánh giá thuốc có hiệu lực triệt để với cầu trùng; nếu vẫn thấy Oocyst trong phân nhưng số lượng Oocyst/g phân giảm rõ rệt thì đánh giá thuốc có hiệu lực với cầu trùng nhưng chưa triệt để; nếu thấy số lượng Oocyst/gam phân vẫn không giảm so với trước khi dùng thuốc hoặc giảm không đáng kể thì đánh giá thuốc không có hiệu lực với cầu trùng.
* Phương pháp xác định độ an toàn của thuốc
Độ an toàn của thuốc được đánh giá bằng kết quả theo dõi trạng thái cơ thể, sự vận động, ăn uống và một số chỉ tiêu sinh lý (thân nhiệt, nhịp thở) của bê, nghé trước và sau khi dùng thuốc 1 giờ.
Từ đó chọn được loại thuốc trị cầu trùng cho bê, nghé có hiệu quả cao và an toàn.
3.4.4.3. Đề xuất quy trình phòng trị bệnh cầu trùng cho bê nghé
Từ kết quả thu được về một số đặc điểm dịch tễ, sức đề kháng của
Oocyst cầu trùng và kết quả thử nghiệm thuốc trị cầu trùng, đề xuất quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh cầu trùng cho bê, nghé.
3.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (Nguyễn Văn Thiện, 2008 [22]), trên phần mềm Excel 2003 và phần mềm Minitab 14.0.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. XÁC ĐỊNH LOÀI CẦU TRÙNG KÝ SINH Ở BÊ NGHÉ CỦA 3 XÃ THUỘC HUYỆN ĐỒNG HỶ - TỈNH THÁI NGUYÊN XÃ THUỘC HUYỆN ĐỒNG HỶ - TỈNH THÁI NGUYÊN
Bảng 4.1. Các loài cầu trùng ký sinh ở bê, nghé tại tỉnh Thái Nguyên
Ký hiệu loại Oocyst Số Oocyst theo dõi Kích thước Oocyst (µm) Hình thái và màu sắc Thời gian phát triển thành Oocyst gây bệnh (ngày) Kết luận loài cầu trùng Chiều dài ) (X ±mX Chiều rộng ) (X ±mX O1 5 16,84 ± 1,15 12,60 ± 0,63 Hình trứng, có 1 – 2 lớp vỏ, màu vàng nhạt 4- 5 E.alabamensis (christiensen, 1941) O2 5 26,12 ± 0,74 19,52 ± 0,67 Hình trứng hoặc không đối xứng, có 1 -2 lớp vỏ, màu nâu hay hơi vàng, không có hạt cực, lỗ noãn ở đầu hẹp. 2 - 3 E. bovis (christiensen, 1941) O3 5 17,66 ± 0,70 15,38 ± 0,86 Hình trứng hoặc hình cầu, có 2 lớp vỏ, màu nâu nhạt hoặc không màu, không có hạt cực. 2 - 3 E. zuernii (Rivolta, 1878, Matin,1090)
Kết quả bảng 4.1 cho thấy, bê, nghé nuôi tại 3 xã của huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên nhiễm 3 loại cầu trùng. Căn cứ vào đặc điểm hình thái, kích thước, màu sắc của Oocyst và thời gian hình thành bào tử, căn cứ theo Ajayi J. A. (2004) [33],chúng tôi có nhận xét và kết luận như sau:
- Loại O1: kích thước 16,84 x 12,60 µm, thời gian phát triển thành
Oocyst có sức gây bệnh là 4 - 5 ngày, Oocyst gây bệnh có 4 túi bào tử, trong mỗi túi bào tử có 2 bào tử con. Theo Christiensen (1941), loài
Eimeria alabamemsis có kích thước dài từ 13 - 24 µm, rộng từ 11 - 16 µm.
Thời gian hình thành bào tử là 4 - 5 ngày. Vì vậy, chúng tôi kết luận O1
chính là Eimeria alabamemsis.
- Loại O2: kích thước 26,12 x 19,52 µ m, thời gian phát triển thành
Oocyst có sức gây bệnh là 2 - 3 ngày, Oocyst gây bệnh có 4 túi bào tử, trong mỗi túi bào tử có 2 bào tử con. Theo Christiensen (1941) loài
Eimeria bovis có kích thước dài từ 23 - 34 µ m, rộng từ 17 - 23 µ m.
Thời gian hình thành bào tử là 2 - 3 ngày. Vì vậy, chúng tôi kết luận O2
chính là Eimeria bovis.
- Loại O3: kích thước 17,66 x 15,38 µm, thời gian phát triển thành
Oocyst có sức gây bệnh là 2 - 3 ngày, Oocyst gây bệnh có 4 túi bào tử, trong mỗi túi bào tử có 2 bào tử con. Theo Rivolta (1978) và Martin (1909), loài
Eimeria zuernii có kích thước dài từ 15 - 22 µm, rộng từ 13 - 18 µm. Thời gian hình thành bào tử là 2 - 3ngày. Vì vậy, chúng tôi kết luận O3 chính là
Eimeria zuernii.
Qua kết quả bảng 4.1 và những vấn đề thảo luận ở trên chúng tôi có nhận xét: bê, nghé nuôi tại 3 xã của huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên nhiễm 3 loài cầu trùng sau: E. alabamemsis, E. zuernii, E. bovis. Cả 3 loài trên thuộc giống Eimerridae, phân ngành Apicomplexa. Đây là 3 loài cầu trùng phổ biến nhất và gây hại lớn cho bê, ngé của nhiều nước trên thế giới