Mẫu cá được thu từ những ao có dấu hiệu bệnh. Trong điều kiện tiệt trùng, gan, thận và tỳ tạng của các mẫu cá có dấu hiệu bệnh mủ gan, xuất huyết và mẫu cá khỏe được cấy trên môi trường chung TSA (Tryptone soya agar), những khuẩn lạc chiếm ưu thế có màu sắc, hình dạng và kích thước đặc trưng của nhóm E. ictaluri (sau 48 giờ) dựa theo mô tả của Hawke et al., (1981), Từ Thanh Dung (2004) và nhóm Aeromonas spp(sau 24 giờ) theo mô tả của Marja-liisa Hänninen (1997), Austin & Austin (2007), được tách ròng, một số chỉ tiêu cơ bản gồm: nhuộm Gram, hình dạng, tính di động, phản ứng catalase, oxydase, phản ứng O/F, được thực hiện trước khi định danh bằng bộ kit API 20E. Ngoài ra đối với nhóm vi khuẩn Aeromonas spp còn được kiểm
tra với thuốc thử 0/129. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu này được thể hiện bảng 4.3
Hình 4.4 Cá tra bị bệnh xuất huyết, mắt bị sưng và lồi, các vi, hầu và da có nhiều đốm đỏ
Hình 4.3 Cá tra bị bệnh mủ gan, có nhiều đốm mủ trắng trên gan, thận và tỳ tạng và trong xoang cơ thể có chất dịch màu vàng
Hình 4.5 Khuẩn lạc Aeromonas spp
phát triển trên môi trường TSA sau 24 giờở 28-30oC, kích thước nhỏđường kính 1-2 mm có màu trắng đục hay kem.
Hình 4.6 Khuẩn lạc E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA sau 48 giờ ở 28-30oC, kích thướt li ti có màu trắng đục.
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh hóa của vi khuẩn
Edwardsiella ictalurivà Aeromonas spp
STT Chỉ tiêu E. ictaluri Aeromonas spp
1 Gram Âm Âm
2 Hình dạng Que ngắn Que ngắn 3 Di động + + 4 Oxydase - + 5 Catalase + + 6 O/F +/+ +/+ 7 0/129 kháng +: dương tính; -: âm tính.
Qua kết quả kiểm tra ban đầu về hình dạng và các chỉ tiêu sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập được ở Trà Vinh và Bến Tre giống như mô tả trước đây Hawke et al., (1981), Fugerson et al., (2001), Từ Thanh Dung (2004) như di dộng yếu ở 25-30o
C, không di động ở nhiệt độ cao hơn, oxydase âm tính, catalase dương tính, lên men và oxy hóa…
Đối với chủng Aeromonas spp kết quả kiểm tra ban đầu cũng giống như mô tả của Marja-liisa Hänninen (1997), Bùi Quang Tề (2006) đây là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động nhờ tiêm mao, vi khuẩn yếm khí tùy tiện, oxydase và catalase dương tính và không mẫn cảm với thuốc thử 0/129.
4.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn E. ictaluri và Aeromonas sppbằng bộ kit API 20E
Qua kết quả kiểm tra chỉ tiêu sinh hóa của các chủng E. ictaluri cho thấy rằng hầu hết các phản ứng đều âm tính ngoại trừ GLU và CIT cho phản ứng dương tính. Khi so sánh với các kết quả định danh chủng này bằng bộ kít API 20E của các tác giả trước đó Hawke et al., (1981), Từ Thanh Dung (2004), Châu Hồng Thúy (2008), là phù hợp.
Hình 4.6 Hình dạng đặc trưng của vi khuẩn Aeromonas spp Gram âm, hình que ngắn
Hình 4.6 Hình dạng đặc trưng của vi khuẩn E. ictaluri Gram âm, hình que ngắn
Hình 4.9 Kết quảđịnh danh Aeromonas spp bằng bộ kit API 20E
Theo Marja-liisa Hänninen et al (1997) và popovic et al (2007), vi khuẩn Aeromonas spp được định danh bằng bộ kit API 20E cho rằng các chỉ tiêu dương tính gồm LDC, VP, GEL, RHA. Theo Austin & Austin (1993) các chỉ tiêu dương tính gồm ONPG, ADH, IND, VP, GEL, GLU, ARA. Khi so sánh kết quả định danh vi khuẩn Aeromonas spp phân lập được với kết quả của các tác giả trước và kết quả định danh Aeromonas hydrophyla dòng chuẩn thì chủng Aeromonas spp cần kiểm tra là phù hợp.
4.3 Kết quả làm kháng sinh đồ
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 8 dòng vi khuẩn Aeromonas spp (4 dòng của tỉnh Trà Vinh, 4 của tỉnh Bến Tre) và 12 dòng vi khuẩn E. ictaluri (6 dòng của tỉnh Trà Vinh, 6 dòng của tỉnh Bến Tre) với 8 loại thuốc kháng sinh: florfenicol (FFC) (30 µg); tetracycline (TE) (30 µg);; cefazoline (CEZ) (30 µg); chloramphenicol (CHL) (30 µg); doxycycline (DO) (30 µg); ampicilline (AM) (30 µg); streptomycin (SM) (10 µg) cho kết quả như sau:
4.3.1 Kết quả làm kháng sinh đồ Aeromonas spp 100 100 0 0 87.5 12.5 0 0 100 0 100 0 0 87.5 012.5 0 100 0 0 50 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % K h á n g t h u ố c k h á n g s in h FFC TE CEZ CHL DO AM SM Thuốc kháng sinh Nhạy Kháng Trung Bình
Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn Aeromonas spp
Từ kết quả kháng sinh đồ của các chủng Aeromonas spp phân lập ở Trà Vinh và Bến Tre cho thấy có 87,5% các chủng nhạy với tetracycline (TE) và doxycycline (DO). Như vậy hai loại kháng sinh này vẫn còn khá nhạy với vi khuẩn Aeromonas spp nơi đây. Theo kết quả điều tra có 41,94% cá hộ nuôi được phỏng vấn sử dụng doxycycline để điều trị bệnh trên cá nuôi, dựa theo kết quả kháng sinh đồ trong những trường hợp cần thiết phải dùng kháng sinh thì loại thuốc này vẫn có thể điều trị còn hiệu quả khi cá nuôi bị nhiễm vi khuẩn Aeromonas spp dù đã có 12,5% chủng nhạy ở mức trung bình. Trong khi đó có 12,5% chủng đã kháng với tetracycline. Theo Tendencia et al (2001) có 23% kháng oxytetracycline. Mohamed Nawaz (2006) 25% kháng tetracycline. Depaola et al (1988) 32% chủng vi khuẩn Aeromanas hydrophyla
phânlập từ cá kháng với tetracycline. Theo Sarter et al (2006) thì các dòng vi khuẩn Gram âm phân lập từ catfish đã kháng với ampiciline, tetracycline. Dù kết quả cho thấy tetracycline vẫn còn tương đối nhạy với Aeromonas spp nhưng chỉ có 9,7% số hộ nuôi được phỏng vấn ở đây sử dụng tetracycline để điều trị bệnh trên cá.
Qua kết quả kháng sinh đồ cho thấy 100% vi khuẩn Aeromonas spp nhạy với kháng sinh thuộc nhóm phenicol là florfenicol (FFC) và chloramphenicol (CHL), và nhạy ở mức khá cao. Florfenicol với đường kính vòng vô trùng đều nằm trong khoảng từ 30-40 mm. Theo Depaola et al (1995) và Tendencia et al (2001) không tìm thấy chủng Aeromonas spp nào kháng với chloramphenicol nhưng Hatha and Vivekanandan (2005) đã tìm thấy có 4,4% số chủng Aeromonas hydrophyla phân lập được từ cá đánh bắt ngoài tự nhiên đã kháng với Chloramphenicol. Chloramphenicol là loại kháng sinh đã bị cấm trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam nhưng một dẫn xuất khác của nó là florfenicol vẫn dang được phép sử dụng và đang được sử dụng để điều trị
khá hiệu quả các bệnh nhiễm khuẩn trên cá. Theo kết quả khảo sát thì có 61,29% số hộ nuôi sử dụng florfenicol để điều trị
Theo nhiều nghiên cứu trước đây thì vi khuẩn Aeromonas spp đã kháng tự nhiên với ampiciline (AM) và kết quả cho thấy 100% chủng Aeromonas spp phân lập được ở Trà Vinh và Bến Tre đều kháng với loại kháng sinh này. Lợi dụng tính chất kháng tự nhiên của vi khuẩn này với ampiciline mà nhiều tác giả đã đưa ampiciline vào trong môi trường chọn lọc để phân lập vi khuẩn
Aeromonas spp (Frerichs and Millar, 1993).
Tương tự như ampiciline, theo kết quả kháng sinh đồ cefazoline (CEZ) cũng là loại kháng sinh đã bị kháng hoàn toàn với Aeromonas spp, tất cả đều không tạo vòng vô trùng, dù kết quả khảo sát thì loại kháng sinh này cũng không được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh ở đây. Theo Depaola et al
(1995) chỉ có 7.1% chủng Aeromonas hydrophyla kháng với Cefazoline. Trong nghiên cứu này lại cho kết quả 100% số vi khuẩn Aeromonas spp kháng với Cefazoline chứng tỏ theo thời gian thì việc kháng thuốc của vi khuẩn trên một loại thuốc sẽ tăng lên.
Theo Crumlish et al (2002) khi nghiên cứu của vi khuẩn Aeromanas hydrophyla gây bệnh trên cá tra ở ĐBSCL thì streptomycin (SM) vẫn còn nhạy với với loài này. Hatha and Vivekanandan (2005) có 9,3% số chủng
Aeromanas hydrophyla kháng với streptomycin, đến năm 2006 Aeromanas hydrophyla phân lập trên cá tra ở ĐBSCL bị bênh xuất huyết đã có tới 10/12 (83,3%) số chủng kháng với streptomycin. Theo Adanir and Turutoglu (2007) có 100% các chủng Aeromanas hydrophyla phân lập trên cá chép bị bệnh đốm đỏ kháng với streptomycin, nhưng trong nghiên cứu này streptomycin vẫn còn nhạy trên 50% số vi khuẩn. Kết quả đó là do đây là khu vực mới nuôi cá trong những năm gần đây nên việc kháng thuốc chưa xảy ra phổ biến và dựa theo kết quả điều tra thì hầu hết người dân không sử dụng loại kháng sinh này để điều trị bệnh cho cá nuôi.
Bên cạnh đó, theo kết quả kháng sinh đồ ta cũng thấy xuất hiện hiện tượng đa kháng (một chủng vi khuẩn đã kháng với hai, ba loại kháng sinh) của các chủng Aeromonas spp phân lập ở Trà Vinh và Bến Tre. Hiện tượng đa kháng của Aeromanas hydrophyla cũng đã được đề cập bơi Mcnicol et al
(1980) là đã tìm thấy 57% số vi khuẩn kháng với hai loại kháng sinh streptomycin-tetracycline. Trong nghiên cứu này có 5/8 chủng Aeromonas spp (62,5%) lập kháng sinh đồ đã kháng với ba loại kháng sinh, trong đó có 50% số chủng kháng với 3 loại kháng sinh AM+CEZ+SM và 12,5% kháng với AM+CEZ+TE, tỷ lệ đa kháng của các chủng vi khuẩn gây bệnh ở đây là khá cao, điều này là do việc kết hợp kháng sinh không đúng và việc sử dụng kháng sinh không theo hướng dẫn của nông dân. Những loại vi khuẩn này khi gây bệnh sẽ gặp rất nhiều khó khăn trong điều trị, hiện tượng kháng thuốc sẽ ngày càng trở nên nghiêm trọng hơn.
4.3.2 Kết quả làm kháng sinh đồ E. ictaluri100 100 0 0 0 83 17 58 42 0 100 0 0 50 50 0 58 17 25 42 58 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % K h á n g t h u ố c k h á n g s in h CEZ SM TE AM FFC DO CHL Thuốc kháng Sinh Nhạy Kháng Trung Bình
Hình 4.12 Tỷ lệ phần trăm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. ictaluri
Qua kết quả kháng sinh đồ cho thấy, trái lại với kết quả của chủng
Aeromonas spp là 100% kháng với cefazoline (CEZ) và ampiciline (AM) với việc không tạo vòng vô trùng còn đối với vi khuẩn E. ictaluri phân lập được ở Trà Vinh và Bến Tre trong nghiên cứu này thì tất cả đều nhạy với cefazoline và ampiciline với vòng vô trùng rất lớn (30-40 mm). Từ kết quả điều tra thì không có hộ nuôi nào sử dụng ampiciline để điều trị và sử dụng cefazoline rất ít (16,2%). Theo Depaola et al (1995) nghiên cứu sự kháng thuốc của 22 chủng E. tarda trên hai lại kháng sinh này cũng không tìm thấy chủng nào bị kháng. Từ kết quả của nghiên cứu này cho thấy trong những trường hợp bệnh bộc phát nặng, bắt buộc phải dùng kháng sinh để điều trị thì có thể sử dụng cefazoline và ampiciline để điều trị bệnh cho cá khi bi bệnh do nhiễm vi khuẩn
E. ictaluri.
Đối với nhóm kháng sinh tetracycline và doxycycline, chỉ hơn phân nửa số vi khuẩn E. ictaluri (58%) trong nghiên cứu còn nhạy với hai loại kháng sinh này. Theo nghiên cứu về sự kháng thuốc của E. ictaluri phân lập ở ĐBSCL của Crumlish et al (2006) tính nhạy của loài vi khuẩn này lên
doxycycline là 83,3% (10/12). Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan (2007) là 72,3% và trong một nghiên cứu về sự kháng thuốc của E. ictaluri ở Trà Vinh gần đây của Châu Hồng Thúy (2008) tính nhạy của vi khuẩn này còn 60% với tetracycline và 66,7% với doxycycline. Đến nghiên cứu này thì tính nhạy của loài vi khuẩn này với 2 lọai kháng sinh trên chỉ còn 50%. Qua đó cho thấy tính nhạy của E. ictaluri giảm dần theo thời gian nuôi của người dân, do đó việc sử dụng hai loại kháng sinh này để điều trị bệnh cho cá nuôi ở đây là phải hết sức cân nhắc do hiện tại theo kết quả khảo sát vẫn còn khá nhiều hộ (41,94%) số hộ được phỏng vấn sử dụng doxycycline để điều trị bệnh cho cá.
Với kháng sinh thuộc nhóm phenicol đã có 50% chủng E. ictaluri đề kháng với florfenicol và chloramphenicol. Crumlish và ctv (2002) ghi nhận
các chủng E. ictaluri phân lập trên cá tra ở Việt Nam nhạy cảm hoàn toàn với
florfenicol đến năm 2006 Crumlish et al (2006) đã tìm được 57,1% số chủng kháng với florfenicol. Sau thời gian phát triển nghề nuôi và dịch bệnh thường xuyên xảy ra, nông dân đã sử dụng nhiều lọai kháng sinh đểđiều trị bệnh cho cá. Kết quả đã hình thành các chủng E. ictaluri kháng florfenicol (50%) cho đến thời điểm hiện tại. Theo Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan (2007) có 42,5% chủng E. ictaluri kháng với florfenicol và Châu Hồng Thúy (2008) 16,7 % chủng E. ictaluri ở Trà Vinh là kháng với chloramphenicol. Qua kết quả điều tra thì số nông dân ở đây sử dụng florfenicol để điều trị bệnh cho cá là khá cao (61,29%) nên đã dẫn đến hiện tượng kháng của E. ictaluri
đối với loại kháng sinh này.
Tương tự với vi khuẩn Aeromonas spp , E. ictaluri cũng đã kháng với streptomycin, mặc dù những nghiên cứu trước đây cho rằng vi khuẩn E. ictaluri hoàn toàn nhạy với loại kháng sinh này Waltman & Shotts (1986); Stock & Wiedemann (2001), trong một nghiên cứu gần đây của Crumlish et al (2006) 12/14 số vi khuẩn E. ictaluri (85,7%) kháng với streptomycin và Từ Thanh Dung và ctv (2008) thì cũng cho kết quả 83% vi khuẩn E. ictaluri
kháng với loại kháng sinh này. Theo Bùi Kim Tùng (2001) streptomycin không hấp thu qua đường ruột, trong thủy sản kháng sinh chủ yếu được sử dụng bằng cách cho ăn qua đường tiêu hóa, loại kháng sinh này không nên sử dụng trong thủy sản rất dễ tạo ra hiện tượng kháng thuốc. Mặc dù streptomycin không được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản và kết quả điều tra cũng không thấy nông dân ở Trà Vinh và Bến Tre sử dụng nhưng hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đối với loại kháng sinh này lại xảy ra có thể là do streptomycin được sử dụng rất nhiều để chữa bệnh cho người và gen kháng thuốc của vi khuẩn trên người đã truyền qua vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản.
Hiện tượng đa kháng của E. ictaluri cũng tìm được trong nghiên cứu, có 7/12 chủng vi khuẩn (58,3%) kháng với hai loại kháng sinh trở lên. Tình trạng phổ biến hiện nay là nông dân thường kết hợp nhiều loại kháng sinh để điều trị cùng lúc. Thêm vào đó, trước đây nhiều thuốc kháng sinh bán trên thị
trường kết hợp hai hay nhiều loại kháng sinh trong cùng một sản phẩm cũng là nguyên nhân hình thành vi khuẩn đa kháng. Theo nghiên cứu về vi khuẩn E.
ictaluri đa kháng của Từ Thanh Dung và ctv (2008) phân lập ở ĐBSCL thì có tỷ lệ cao hơn 73,4% ở Trà Vinh và Bến Tre. Sở dĩ nơi đây hiện tượng đa kháng của vi khuẩn thấp hơn là do các hộ dân nơi đây sử không nhiều chủng loại, theo kết quả diều tra thì chỉ có 7 loại là được sử dụng phổ biến.
4.4 Kết quả giá trị MIC
Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản trong giai đoạn hiện nay là cần thiết. Để sử dụng kháng sinh có hiệu quả thì phải dùng đúng cách, đúng thời gian và liều lượng qua đó hạn chế được hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. Xác định giá trị MIC của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh sẽ phần nào giúp cho việc sử dụng kháng sinh đúng liều.
Kết quả giá trị MIC của ba loại kháng sinh tinh chloramphenicol, oxytetracycline và streptomycine lên chủng vi khuẩn chuẩn E. coli ATTCC 25922 không khác biệt so với kết quả có trong tài liệu CLSI M49-A sau khi ủ 24-48 giờ ở 37o
C.
4.4.1 Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas spp
Kết quả cho thấy không có hiện tượng kháng thuốc của Aeromonas spp xảy ra trên hai loại kháng sinh oxytetracycline và chloramphenicol, đều này phù hợp với kết quả kháng sinh đồ. Nhưng trong một nghiên cứu về MIC của của Akinbowale et al (2006) trong tổng số 22 Aeromonas spp có 2 chủng đã kháng với chloramphenicol và 45,5% số vi khuẩn kháng với oxytetracycline và Crumlish et al (2006) đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophyla phân lập ở ĐBSCL đã tìm thấy 66,7% số vi khuẩn kháng với oxytetracycline. Nhưng do giới hạn của đề tài chỉ làm MIC trên 4 chủng vi khuẩn Aeromonas spp phân lập được ở Trà Vinh và Bến Tre nên không tìm thấy kháng với oxytetracycline, điều này cũng có thể lý giải là do nông dân ở nơi đây không sử dụng nhiều oxytetracycline để phòng và trị bệnh cho cá và phù hợp với kết quả điều tra chỉ có 12,9% số hộ nuôi sử dụng oxytetracycline để điều trị.
Qua bảng 4.5 cho thấy chloramfenicol vẫn còn nhạy với Aeromonas
spp nhưng tất cả đều ở mức khá cao 8 µg/ml, đối với oxytetracycline thì nhạy