- Bước 2: Giai đoạn gắn mồi (annealing).
Chương 4 BÀN LUẬN
4.4. MỨC Đ PHIÊN M GN AID TRÊN MÔ GAN VÀ MÔ DẠ DÀY
AID là thành viên của gia đình APOBEC (Apolipoprotein B-editing catalytic polypeptide) bao gồm APOBEC1, -2, -3A, -3B, -3C, -3DE, -3F, -3G, -3H và -4 [33]. Gia đình APOBEC có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng nội môi và đáp ứng miễn dịch bằng cách gây đột biến trên gen đích của DNA hoặc RNA [33]. Chẳng hạn như APOBEC1 có vai trò trong việc điều hòa chuyển hóa lipid bằng sự thay đổi nucleotid ở những vị trí đặc biệt
trên mRNA apoB, dẫn đến mã kết thúc stop codon. Các mRNA apoB đột
biến này mã hóa cho apoB có kích thước ngắn hơn và tham gia cấu tạo chylomicron. apoB 100 (sản ph m của mRNA apoB không bị đột biến) tham gia cấu tạo lipoprotein có t trọng thấp LDL (lipoprotein density lipoprotein) và rất thấp (very lo density lipoprotein) [119]. APOBEC3G có hoạt tính kháng virus, bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công của retrovirus bằng cách gây đột biến trên hệ gen của virus. Ngoài ra, phản ứng khử amin của APOBEC3G được cho là có tác dụng kháng và hạn chế sự phát triển của virus HIV [48], [58]. Trong gia đình APOBEC, chỉ AID mới có khả năng gây thay đổi trình tự nucleotid trên DNA của người.
Nhóm nghiên cứu của Tasuku Honjo và cộng sự đã tạo ra chuột chuyển gen AID, trong đó sự biểu hiện của AID không chỉ tại tế bào lympho B hoạt hoá mà còn ở nhiều cơ quan khác nhau để đánh giá vai trò của AID [86]. Kết
quả chỉ ra rằng sự phát sinh, phát triển ung thư xảy ra tại nhiều cơ quan khác nhau trên chuột chuyển gen AID. Trong đó ung thư tế bào gan và ung thư dạ dày được phát hiện với tỷ lệ tương ứng là 25% và 34% trong tổng số chuột chuyển gen nghiên cứu. Phân tích tiêu bản mô bệnh học đã cho thấy hình ảnh điển hình của ung thư tế bào gan biệt hoá cao và ung thư biểu mô tuyến dạ dày [86]. iều này chứng tỏ rằng sự tăng cường biểu hiện AID tại tế bào gan và dạ dày của chuột đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh ung thư tại hai cơ quan nói trên.
Với hy vọng tìm mối liên quan giữa mức độ phiên mã gen AID với quá trình phát sinh, phát triển ung thư gan và ung thư dạ dày, nghiên cứu đã khảo sát mức độ phiên mã gen AID ở mô gan người trong tình trạng viêm, xơ và ung thư; mô dạ dày trong tình trạng viêm và ung thư. Nhóm nghiên cứu đã đánh giá mức độ phiên mã gen AID trên 5 mẫu mô gan viêm, 10 mẫu mô gan xơ và 30 mẫu mô ung thư gan 5 mẫu mô dạ dày viêm và 72 mẫu mô dạ dày ung thư cùng với mẫu mô lành thuộc mỗi đối tượng được thu thập để làm đối chứng với số lượng tương đương bằng kỹ thuật Real-time PCR.
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. ặc trưng của Real-time PCR là phát hiện sản ph m khuếch đại trong quá trình chạy PCR khi sản ph m khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đạt đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Chínhình ờ đặc trung này mà có thể biết được số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngư ng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn.
Có hai cách định lượng tác nhân đích: định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối. Phương pháp định lượng tuyệt đối đòi hỏi phải biết rõ lượng (thể tích, hay có thể là trọng lượng) của mẫu thử. Phương pháp định lượng tương đối được sử dụng khi người làm thí nghiệm không thể cân đo đong đếm
được mẫu thử để có được số lượng chính xác. Có thể định lượng tương đối dựa trên đơn vị khối lượng (unit mass), định lượng tuơng đối dựa trên gen nội chu n, định lượng tương đối dựa trên khối lượng vật chủ. Do không xác định chính xác lượng mRNA ban đầu nên nghiên cứu này sử dụng phương pháp
định lượng tương đối dựa trên gen nội chu n [23].
ể đánh giá chính xác của phương pháp cũng như lượng mRNA đưa vào ban đầu trong các mẫu của phản ứng Real-time PCR, ngoài việc định lượng mRNA của gen AID, gen nội chu n β-actin cũng được tiến hành song song. Gen nội chu n là một gen luôn biểu hiện ổn định trong tất cả các mô, tế bào, do đó người ta thường sử dụng gen này để làm đối chứng. Mức độ phiên mãgen AID s được tính toán dựa vào kết quả Real-time PCR của gen AID và
gen β-actin thông qua chu kỳ ngư ng (Ct). Sử dụng phương pháp 2-Ct của
Livak để định lượng tương đối mức độ phiên mã các gen tại mô bệnh (mô tại vị trí khối u) và mô lành (mô cách vị trí khối u 5 cm) [69].
4.4 Nh ô gan
Cho đến hiện nay việc chẩn đoán sớm ung thư gan vẫn đang là một thách thức đối với y học vì hầu hết bệnhình ân khi được phát hiện thường ở giai đoạn muộn. Do đó việc tìm ra các dấu ấn phân tử mới nhằm chẩn đoán sớm và chẩn đoán xác định đang là hướng đi được các nhà khoa học quan tâm hiện nay. Một trong những dấu ấn đó là AID (ở dạng gen hoặc protein).
Gần đây các nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự tăng cường biểu hiện AID ở mô gan ung thư, gan xơ và gan viêm [41], [66]. Endo Y và cộng sự
nghiên cứu in vitro sử dụng dòng tế bào gan người nuôi cấy cũng đã chứng
minh sự gia tăng biểu hiện AID ở mức độ mRNA và protein thông qua sự hoạt hóa kênh dẫn truyền tín hiệu Nuclear Factor kappa B (NF-kB) và virus viêm gan C, tác nhân chính gây ung thư gan có tác dụng làm tăng cường sự biểu hiện AID. Việc biểu hiện quá mức AID đã làm tích lũy sự biến đổi vật liệu di truyền ở các gen c-myc và pim1. iều này gợi ý rằng AID đóng vai trò như một tác nhân gây đột biến và làm tăng cường tínhình ạy cảm của tế bào
gan với các tác nhân gây đột biến gen. Trên mô hình chuột chuyển gen AID, 4/16 số chuột có khối ung thư gan. Như vậy, sự biểu hiện quá mức AID có thể là một tác nhân độc với hệ di truyền phát sinh ung thư gan [41].
Với hy vọng nghiên cứu tìm mối liên quan giữa sự phiên mã gen AID với quá trình phát sinh và phát triển ung thư gan, nghiên cứu này đã khảo sát mức độ phiên mã gen AID ở tế bào gan người trong tình trạng viêm, xơ và ung thư. Nghiên cứu đã đánh giá mức độ phiên mã gen AID trên 5 mẫu mô gan viêm, 10 mẫu mô gan xơ và 30 mẫu mô ung thư gan cùng với các mẫu mô lành thuộc mỗi đối tượng được thu thập để làm đối chứng với số lượng tương đương bằng kỹ thuật Real-time PCR.
Kết quả cho thấy: mức độ phiên mã gen AID trên mô gan ung thư so với
mô gần khối u (mô lành) là 11,09 4,73 lần, mô gan viêm so với mô gần khối
viêm là 2,18 0,75 lần, mô gan xơ so với mô gần khối xơ là 7,87 1,97 lần.
Như vậy, mức độ phiên mã gen AID ở mô gan ung thư cao hơn có ý nghĩa so với mô gan viêm và mô gan xơ với p<0,05 (biểu đồ 3.6). Kết quả thu được
khác với kết quả trên nghiên cứu in vitro sử dụng dòng tế bào nuôi cấy của
các tác giả khác. Theo nghiên cứu của Chiba và cộng sự, mức độ phiên mã
gen AID ở mô gan viêm so với mô gần khối viêm là 38,7 10,0 lần, mô gan
xơ so với mô gần khối xơ là 81,2 18,9, mô gan ung thư so với mô gần khối
u là 122,2 34,3 lần [66]. So với kết quả nghiên cứu của Chiba và cộng sự,
kết quả nghiên cứu này thấp hơn. iều này có thể được lý giải do sự không đồng nhất của các mô nghiên cứu về mức độ phong phú của các dòng tế bào và tỷ lệ khác nhau về số lượng và tỷ lệ các tế bào ung thư/tế bào lành.
Nghiên cứu của Endo và cộng sự cho thấy khi kích thích yếu tố TNF-α của tế bào gan người nuôi cấy gây biểu hiện AID. Sự tăng biểu hiện AID ở tế bào viêm gan được cho là do hoạt hóa NF-kB, bởi vì sự biểu hiện của AID được loại bỏ hoàn toàn bởi yếu tố ức chế 1kBα (một yếu tố ức chế NF-kB đặc biệt) [41]. NF-kB là yếu tố được biết đến nhiều nhất trong quá trình phát sinh
phản ứng viêm và được hoạt hóa bởi các cytokin tiền viêm như là TNF-α (tumor necrosis factor), virus hoặc vi khu n [74]. Khi nghiên cứu trên dòng tế bào gan HepG-2, nhóm nghiên cứu của Chiba và cộng sự đã chứng minh rằng sự có mặt các phân tử protein được tổng hợp từ bộ gen virus viêm gan C trong tế bào Hep-2 thì protein AID được gia tăng biểu hiện một cách rõ rệt khi phân tích bằng kỹ thuật dánh dấu miễn dịch (immunoblot) trên bản gel acrylamide [41], [78]. Hơn nữa, dưới tác dụng của yếu tố hoạt hóa khối u alpha (tumor necrosis factor alpha, TNF-α), một yếu tố then chốt trong quá trình gây viêm, ung thư hoá và đóng vai trò quan trọng trong quá trìnhình ân lên của virus, tế bào HepG-2 cũng tăng cường tổng hợp AID một cách rõ rệt ở cả hai mức độ mRNA và protein [41], [78]. Vì vậy, nghiên cứu này cũng đã tìm hiểu xem HBV có gây tăng sao chép gen AID ở mô gan hay không. Kết quả cho thấy, mức độ phiên mã gen AID trên mô gan nhi m HBV (9,81 ± 5,26) cao hơn so với mô gan không nhi m HBV (7,89 ± 3,06) (biểu đồ 3.7). Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p 0,05). Kết quả nghiên cứu này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Kou T và cộng sự [66]. Nghiên cứu của Kou T và cộng sự cho thấy không có sự khác biệt về mức độ phiên mã gen AID ở mô gan nhi m HBV và mô gan không nhi m HBV [66].
4.4.2 Nh ô dạ dày
Tương tự ở nhóm bệnhình ân gan, kỹ thuật Real-time PCR được sử dụng
với cặp mồi đặc hiệu của -actin và AID để đánh giá mức độ sao chép gen
AID ở mô dạ dày của bệnhình ân viêm dạ dày và UTDD nhằm khảo sát xem liệu AID có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học trong chẩn đoán và tiên lượng UTDD. Mức độ phiên mã gen AID cũng được xác định dựa trên việc so sánh đánh giá cường độ các tín hiệu huỳnh quang của gen AID và nội
chu n -actin. Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ phiên mã gen AID ở mô
UTDD so với mô lành là (11,76 lần) và trên mô dạ dày viêm so với mô gần khối viêm là (1,6 lần) (bảng 3.15, 3.16, 3.17 và biểu đồ 3.8).
ức độ phi n m gen AID ở các giai đoạn i t hóa của ung thư dạ dày:
Liệu mức độ phiên mã gen AID trên mô dạ dày ung thư có thay đổi khác nhau ở các giai đoạn biệt hóa theo độ mô học của khối u hay không. Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát mức độ phiên mã gen AID trên mô UTDD thể biệt hóa kém, thể biệt hóa vừa và thể biệt hóa rõ. Kết quả cho thấy, mức độ phiên mã gen AID trên mô ung thư dạ dày so với mô lành cao ở thể biệt hóa kém, thấp hơn ở thể biệt hóa rõ và thể biệt hóa vừa (biểu đồ 3.9). iều này cho thấy gen AID là một trong những tác nhân liên quan chặt ch với quá trình phát sinh và phát triển ung thư, mức độ phiên mã gen AID phụ thuộc vào mức độ ác tính của khối u.
4.5. MỐI TƯƠNG QUAN GI A MỨC Đ PHIÊN M G N AID VÀ Đ TBIẾN V TRÍ S 9R TẠI XON 7 CỦA GEN P53