Lớp dịch chứa DNA Lớp cặn tế bào Lớp dịch chiết
Hút lớp dịch DNA, thêm 0,4 ml chloroform:isoamylalcohol (24:1)
Ly tâm 8000 vòng/ phút x 10 phút
Loại bỏ dịch nổi, tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối
Ly tâm 13000 v/p trong 20 phút
Loại bỏ dịch nổi, thu cặn DNA
Thêm ítình ất 1ml ethanol 70% để rửa cặn Ly tâm 13000 vòng/ phút 20 phút
50 µl TE
Dịch DNA
2.3.3. Quy r nh ách chi RNA ổng hợ cDNA
Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số từ mô tươi
Mô ung thư hoặc mô xơ hoặc mô viêm (1g) được nghiền trong 1ml Trizol bằng cối nghiền đồng thể, sau đó chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml.
- Thêm 0,2 ml chloroform vào dung dịch nghiền mô ở trên, dùng tay lắc nhẹ ống để trộn đều các dung dịch. Giữ ở nhiệt độ phòng 2 - 3 phút.
- Ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Lúc này dịch
ly tâm s được phân tách làm 3 lớp: lớp trên cùng là lớp dịch chứa RNA, lớp giữa là DNA và lớp dưới cùng là hỗn hợp protein và chloroform.
- Hút lớp dịch trên cùng có chứa RNA. ể tránh dịch RNA bị lẫn DNA, tuyệt đối không hút vào lớp ở giữa.
- Thêm 0,5 ml dịch isopropanol và giữ ở nhiệt độ phòng 10 - 15 phút.
- Ly tâm với tốc độ 15000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch
nổi, thu lấy cặn màu trắng đục. ây chính là cặn RNA thu được.
- Thêm ítình ất 1ml ethanol 70% vào ống eppendorf có chứa cặn, dùng tay đảo ngược ống eppendorf vài lần để rửa cặn. Cặn RNA ở trong ethanol
70% này có thể giữ được 1 tuần nếu chúng ta để ở 4oC hoặc 1 năm nếu ở
-20oC.
- Ly tâm với tốc độ 15000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch
nổi, lấy cặn, mở nắp ống để khô tự nhiên, phần cặn chính là RNA tổng số đã được rửa sạch.
- Giữ khoảng 1 phút để khô cặn RNA. Lưu ý là không để cặn khô quá để tránh làm giảm chất lượng RNA và cặn s khó được hoà tan.
- Hoà tan cặn trong 20 µl nước DEPC (đây là một loại nước có chứa Rnasin, một chất ức chế Rnase), lắc nhẹ cho cặn tan hoàn toàn, dung dịch thu được là dung dịch RNA tổng số.
- Bảo quản dịch RNA ở -70oC.
Sau khi tách chiết, kiểm tra độ tinh sạch của RNA bằng phương pháp đo mật độ quang.
1ml Trizol
0,2 ml chloroform
Mô gan (dạ dày)
Lớp dịch chứa RNA Lớp DNA Lớp dịch chứa protein Hút lớp dịch RNA, thêm 0,5 ml isopropanol Ly tâm 15000 vòng/ phút 15 phút Cặn RNA
Loại bỏ dịch nổi, thu cặn RNA
Thêm ítình ất 1ml ethanol 70% để rửa cặn Ly tâm 15000 vòng/ phút 15 phút
DEPC
Dịch RNA
Kỹ thuật tổng hợp cDNA từ RNA tổng số
- ây là kỹ thuật tổng hợp chuỗi ngược DNA (cDNA) từ RNA đã được tách chiết ở trên.
- RT-PCR được tiến hành theo quy trình chu n đã được hoàn thiện bởi nhóm nghiên cứu.
* C á ch ti ế n h àn h :
Những mẫu RNA đạt được nồng độ tối ưu và có độ tinh sạch dao động từ 1,8 - 2 s được sử dụng để tổng hợp cDNA.