- Cơ chế thụ tinh
3. ðỐ IT ƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
3.3. Phương pháp nghiên cứu ạLợn ñực
- Thể tích tinh dịch V (ml):
Cho lợn ñực nhảy giá vào buổi sáng hoặc chiều mát. Tinh dịch ñược ñong bằng cốc ñong thủy tinh có vạch chia thể tích, ño ngay sau khi lấy tinh (tinh dịch ñã ñược lọc bỏ keo phèn).
- Phương pháp xác ñịnh hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực của tinh trùng ñược xác ñịnh theo phương pháp của Herrick và Self (1962):
- Xác ñịnh hoạt lực tinh trùng ñối với tinh nguyên: nhỏ 3 giọt tinh nguyên lên lam kính, quan sát trên kính hiển vi, xác ñịnh tỉ lệ % tinh trùng tiến thẳng (Progressive Motility), % tinh trùng vận ñộng tại chỗ và vận ñộng xoay tròn (Local Motility), % tinh trùng không vận ñộng (Immotile), mức ñộ tinh trùng kết dính (Agglutination) và mức ñộ xuất hiện các tế bào khác (Other cells). Ước lượng tỉ lệ trung bình sau khi quan sát từ 3 giọt tinh nguyên.
- Phương pháp xác ñịnh nồng ñộ tinh trùng
Áp dụng phương pháp của Milovanov (1972):
- Chuẩn bị dụng cụ: ống Fancol 10 ml, buồng ñếm Thoma, lamen dài, micropipette, ñèn cồn, kính hiển vị
- Hóa chất: NaCl 10%.
- ðối với tinh nguyên: sau khi ñưa tinh nguyên về tới phòng thí nghiệm, nhanh chóng lấy 50 µl tinh nguyên trộn ñều trong 9950 µl dung dịch NaCl 10%, lắc ñều, ñưa dung dịch vào 2 phía của buồng ñếm hồng cầu Thoma → xác ñịnh mật ñộ tinh trùng → tính nồng ñộ → lượng cần pha vào 1 liều tinh pha loãng (100 ml).
Chú ý: ðối với tinh nguyên cần xác ñịnh mật ñộ tinh trùng thật nhanh chóng và chính xác ñể xác ñịnh liều lượng tinh phạ Tránh ñể tinh trùng chờ lâu trước lúc pha tinh làm ảnh hưởng xấu ñến chất lượng tinh bảo quản.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 40 Hình 8. Buồng ñếm Thoma Hình 9. Vùng ñếm tinh trùng Hình 10. Cách ñếm tinh trùng Công thức tính nồng ñộ tinh trùng
Trong mỗi ô lớn ñều có 16 ô nhỏ (16 ô × 5 = 80 ô nhỏ) Diện tích của ô vuông nhỏ nhất là 0.0025 mm2
Chiều cao của buồng ñếm là 0.1 mm
Như vậy thể tích buồng ñếm là: 0.1 × 0.0025 × 80 = 1/50 mm3
Trong thể tích 1/50 mm3, tinh dịch ñã pha loãng K lần, ta ñếm ñược n tinh trùng. Vậy trong 1mm3 tinh nguyên ta có: C = n.K.50
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
……… 41
- Phương pháp xác ñịnh chỉ tiêu VAC
Chỉ tiêu VAC là chỉ tiêu tổng hợp ñược tính bằng tích của các chỉ tiêu thể tích, hoạt lực và nồng ñộ.
VAC (tỷ/lần) =V (ml) × A (%) × C (triệu/ml)
- Phương pháp xác ñịnh tinh trùng kỳ hình
Làm tiêu bản cố ñịnh và quan sát trên kính hiển vi với ñộ phóng ñại 150 lần.
Cho 300µl tinh pha loãng vào ống Eppendorf có chứa 700µl dung dịch Formolcitrate 4%.
Dùng lam kính sạch, sấy khô, nhỏ một giọt tinh pha ñã ñược cố ñịnh lên lam.
Dùng lamen sạch, trong, ñã sấy khô ñặt nghiêng từ từ lên phần lam kính có chứa giọt tinh pha, sao cho tiêu bản ñược cố ñịnh mà không có bọt khí. Phần dung dịch thừa ñược thấm hết bằng giấy thấm.
ðưa tiêu bản ñã cố ñịnh lên quan sát trên kính hiển vị Quan sát và ñếm số tinh trùng kỳ hình trong tổng số 200 tế bào ñã quan sát ñược.
Các dạng kỳ hình: ñược trình bày trong phần phụ lục.
Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ñược tính bằng tổng số tinh trùng kỳ hình ñếm ñược chia cho 200 tổng số tinh trùng ñược ñếm.
- Phương pháp xác ñịnh tính kháng
Áp dụng phương pháp 2 lọ theo phương pháp của Milovanov (1972):
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
……… 42
Cách tiến hành:
Dùng micropipet hút 0,01 ml tinh dịch nguyên cho vào lọ I ñã chứa sẵn 5 ml NaCl 1%, lắc ñềụ Như vậy, tinh dịch ở lọ thứ nhất ñã ñược pha loãng 500 lần. Hút 0,5 ml dung dịch ở lọ I cho vào lọ II ñã chứa sẵn 0,5 ml NaCl 1%, sau ñó dùng ñũa thuỷ tinh khuấy nhẹ, lắc ñều ở lọ II tinh dịch ñược pha loãng 1000 lần. Lấy một giọt dung dịch ở lọ II ñưa lên kính hiển vi ñể quan sát. Nếu thấy tinh trùng vẫn còn hoạt ñộng thì ta lại cho thêm 0,1 ml NaCl 1% vào trong lọ II, lắc nhẹ, khuấy ñều, rồi lại lấy 1 giọt dung dịch ở lọ II ñưa lên kính hiển vi quan sát. Nếu thấy tinh trùng vẫn còn hoạt ñộng, thì tiếp tục cho thêm 0,1ml NaCl 1% vào lọ II và các bước thao tác ñược làm như trên cho ñến khi tất cả tinh trùng ngừng hoạt ñộng thì dừng lạị
Lúc ñó, sức kháng của tinh trùng ñược tính theo công thức:
R = rơ n.r
Trong ñó: ro là mức pha loãng tinh trùng tại thời ñiểm kiểm tra ñầu tiên
r là mức pha loãng sau mỗi lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% . n là số lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% .
Trong trường hợp của ví dụ trên thì ro = 1000 và r = 100. Như vậy sức kháng của tinh trùng trong trường hợp này là : R = 1000 + n . 100 = 100 (10 +n)
- Phương pháp xác ñịnh giá trị pH của tinh dịch
- ðối với tinh nguyên: dùng giấy quỳ xác ñịnh pH của tinh nguyên, giá trị pH ñược so sánh bằng phương pháp so màu, cần xác ñịnh ngay khi tinh ñược vận chuyển về phòng thí nghiệm. Việc xác ñịnh pH tinh nguyên cần ñược tiến hành nhanh, ñảm bảo thời gian tối thiểu cho ñến thời ñiểm pha tinh.
b. Lợn nái
Dựa vào thẻ nái, sổ ghi chép ñàn lợn ñể thu thập số liệu nghiên cứụ Số con sơ sinh sống ñược xác ñịnh bằng cách ñếm số con còn sống ñến 24 giờ sau khi ñẻ.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
……… 43
Số con cai sữa ñược xác ñịnh bằng cách ñếm số con còn sống và ñủ tiêu chuẩn.
Khối lượng sơ sinh/con: cân khối lượng của từng con bằng cân ñồng hồ loại 5kg.
Khối lượng sơ sinh/ổ bằng tổng khối lượng sơ sinh/con của toàn ổ. Khối lượng cai sữa/con: cân khối lượng từng con vào buổi sáng ngày tách lợn mẹ bằng cân ñồng hồ loại 10kg.
Khối lượng cai sữa/ổ: bằng tổng khối lượng cai sữa/con của toàn ổ.