2.3.4.1.Điều tra qua tài liệu thống kê
Dựa vào các tài liệu thống kê của cơ sở để xác định tình hình mắc tiêu chảy ở ngựa bạch trong những năm trước.
2.3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
- Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng lấy trực tiếp từ trực tràng của ngựa bạch mắc tiêu chảy.
- Mẫu được bảo quản lạnh từ 2 – 80C, ghi chép đầy đủ các thông tin trên phiếu bệnh phẩm và nhãn bệnh phẩm, đảm bảo giống nhau giữa các nhãn và phiếu bệnh phẩm, gửi về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt, gửi về phòng thí nghiệm chậm nhất sau 48 giờ.
2.3.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. Coli
- Phân lập: Mỗi mẫu bệnh phẩm được lần lượt nuôi cấy trên môi trường thạch máu và thạch MacConkey. Bồi dưỡng ở tủ ấm 370C sau 24 giờ. Sau đó chọn khuẩn lạc điển hình, làm tiêu bản trên phiến kính, nhuộm Gram, xem hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn. Tiếp tục nuôi cấy vi khuẩn phân lập được.
- Phương pháp kiểm tra:
+ Dùng que cấy vô trùng, lấy một giọt nước sinh lý để vào phiến kính sạch, dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lác điển hình vi khuẩn E. coli, hòa tan phần khuẩn lac đã được lấy vào giọt nước sinh lý trên phiến kính, cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram:
• Bước 1: Nhỏ dung dịch tím Gemxian lên chỗ cố định vi khuẩn, để 1 – 2 phút, rửa sạch bằng nước, vẩy khô.
• Bước 2: nhỏ dung dịch lugol để 1 phút, rửa nước, vẩy khô. • Bước 3: đổ cồn 900 chảy nhanh qua chỗ phết vi khuẩn đến khi không còn nhuộm màu nữa, rửa sạch bằng nước, vẩy khô.
• Bước 4: nhỏ dung dịch fucsin để 1 phút, rửa nước, vẩy khô. Dùng giấy thấm, thấm khô nước, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học bằng vật kính dầu độ phóng đại 100x, quan sát vi khuẩn.
2.3.4.4. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn E. coli
Sử dụng phương pháp Koch, mẫu là 1 gam phân ngựa bạch tiêu chảy được pha loãng nồng độ b(10-1, 10-2, 10-3,...,10-8), cấy 0,2 ml vào thạch đặc rồi đếm khuẩn lạc (CFU) trên máy đếm.
Số lượng vi khuẩn X trong 1 gam phân được tính theo công thức: X = 5 x a x b
Trong đó:
a: là số lượng CFU trung bình trên một đĩa Petri b: là độ pha loãng mẫu; hệ số 5: vì cấy 0,2 ml
2.3.4.5. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập được Xác định độc lực vi khuẩn E. coli gây bệnh được thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau:
- Bước 1: Các vi khuẩn từ môi trường giữ giống được cấy vào môi trường BHI trong bình tam giác 100 ml sau đó canh trùng được bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ, trong quá trình nuôi có thể lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
- Bước 2: tiêm vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột bạch khỏe mạnh, khối lượng từ 18 – 20 g/con, với liều 0,2 ml/chuột, tiêm xoang phúc mạc.
- Bước 3: cho chuột ăn uống bình thường và theo dõi những biểu hiện, triệu chứng phản ứng sau tiêm, kiểm tra đánh giá số chuột tới 7 ngày.
Căn cứ vào số chuột chết, giờ chuột chết bình quân để dánh giá độc lực của vi khuẩn.
- Bước 4: Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng, mổ khám kiểm tra sự biến đổi của các cơ quan nội tạng, sau đó tiến hành nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm của chuột chết.
2.3.4.6. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn
E. coli phân lập được
- Phương pháp tiến hành:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trương thạch đĩa Muller Hiton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn E. coli được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C. Lấy ½ khuẩn lạc, hòa vào 1,2 ml nước sinh lý để đạt
được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều trên thạch đĩa Muller Hiton.
+ Bước 3: Đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên đĩa thạch.
+ Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 370C/18 – 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩ và so sánh với bảng tiêu chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli đã kiểm tra.