chảy.].
Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là họ vi khuẩn thường trực ở đường ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí, vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và các cơ quan khác ( Lê Văn Tạo, 1997) [12].
Cho đến nay, các nhà khoa học đã xác định được 170 type kháng nguyên O, 80 type kháng nguyên H, 56 type kháng nguyên K và một số kháng nguyên khác. Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực, không có vai trò bám dính, nhưng có vai trò bảo vệ vi khuẩn trong đường ruột, tránh sự tiêu diệt của đại thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong tế bào gan, thận và ngay cả trong đại thực bào (Weinstein và cs, 1984) [30].
2.2.1.6.1. Đặc điểm hình thái cấu trúc vi khuẩn E. coli gây bệnh đường tiêu hóa tiêu hóa
* Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn hình gậy ngắn hai đầu tròn, có kích thước 2 - 3µm x 0,3 - 0,6µm; ở môi trường nuôi cấy, trong canh khuẩn già, xuất hiện trực khuẩn dài 4 -8µm. Trong cơ thể người và động vật, vi khuẩn có hình trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm hơn ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm, có thể thấy giáp mô, nhưng khi soi tươi thì thường không thấy được ( Nguyễn Quang Tuyên, 2008) [19].
* Đặc điểm cấu trúc:
Vi khuẩn E. coli được chia thanh serotype khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên thân O, giáp mô K, lông H và kháng nguyên bám dính F. Bằng phản ứng ngưng kết các nhà khoa học đã tìm ra thêm 250 serotype O; 89 serotype K; 56 serotype H và một số serotype F (Fairbrother.J.M, 1992) [24].
Khi xác định serotype đầy đủ của một chủng vi khuẩn E. coli thì phải xác định đầy đủ cả 3 loại kháng nguyên nói trên.
- Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân – Ohne Hauch) được coi như là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp
với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết. Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ khó tan.
- Kháng nguyên H (kháng nguyên lông – Hauch) là thành phần lông vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn kháng nguyên O.
Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn kháng nguyên O.
Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được quan tâm trong nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất to lớn trong xác định giống loài của vi khuẩn (Orskov.F, 1978) [26].
- Kháng nguyên K ( kháng nguyên vỏ bỏ - Capsular), còn được gọi là kháng nguyên bề mặt ( OMP – Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular). Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất. Có rất nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về mặt độc lực của vi khuẩn, vì thấy rằng độc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống độc lực của chủng không có kháng nguyên K (Orskov.F, 1978) [26]. Tuy nhiên có ý kiến khác cho rằng nó có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ. Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ như sau:
+ Hỗ trợ phản ững ngưng kết kháng nguyên O, nên thường ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky như E. coli O139:K88,
O149:K88, ...
+ Tạo thành hàng rào bảo vệ vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng bệnh của vật chủ.
Tóm lại dựa vào kháng nguyên O, E. coli được chia làm nhièu nhóm; căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H, E. coli lại chia làm nhiều type, mỗi type đều được ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, H, K.
- Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae – kháng nguyên bám dính)
Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt các tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột.
Lê Văn Tạo (2006) [13] cho biết cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn
(Flagella), kháng nguyên vỏ K (Capsula) hoặc còn gọi là OMP (Outer Memberance Protein), và kháng nguyên bám dính F (Fimbriae).
1.2.1.6.2. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn E. coli
* Đặc tính nuôi cấy:
Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [15], Nguyễn Quang Tuyên (2008) [19] vi khuẩn E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (từ 5 – 400C), nhiệt độ thích hợp là 370C và phổ pH rộng (pH từ 5,5 – 8,0), pH thích hợp nhất từ (7,2 – 7,4).
Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Khi nuôi cấy trên các môi trường, để trong tủ ấm 370C và sau 24 giờ vi khuẩn sẽ phát triển như sau:
+ Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 – 3mm. Nuôi lâu khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucous).
+ Môi trường nước thịt: Phát triển rất tốt, môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân hôi thối.
+ Môi trường MacConKey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
+ Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng và gây ra hiện tượng tan máu.
+ Môi trường Simmon citrat: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. + Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu đỏ.
+ Môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen. + Trong môi trường SS: khuẩn lạc màu đỏ. * Đặc tính sinh hóa:
+ Phản ứng lên men đường: vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Frutose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol, lên men không chắc chắn các loại đường Duncitol, Saccrose và Salixin.
Hầu hết các vi khuẩn E. coli đều lên men đườn Lactose nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm quan trọng để dựa vào đó phân biệt vi khuẩn E. coli và
Salmonella.
+ Một phản ứng sinh hóa khác: Phản ứng Indol và MR (Methyl Red) dương tính, phản ứng H2S, VP (Voges Proskauer) âm tính, hoàn nguyên nitrat thành nitrit (Nguyễn Quang Tuyên, 2008) [19].
1.2.1.6.3. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli
* Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli
Để có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E. coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính như kháng nguyên F. Sau đó,
nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sễ xâm nhập vào các tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá hủy lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đường ruột
Enterotoxin. Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng cơ học, làm nhu động ruột tăng, đẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột , vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu. Trong máu vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ tuần vi khuẩn đến các tổ chức cơ quan. Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá hủy tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá hủy tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết.
* Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli
Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, Yếu tố dung huyết và khả năng sản xuất độc tố. Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh.
Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân lập loại vi khuẩn E. coli thành các loại sau: Enterotoxigenic E. coli (ETEC),
Enteropathgenic E. coli (EPEC), Adherence Enteropathogenic E. coli
(AEEC) và Verotoxingenic E. coli (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997) [12].
- Yếu tố kháng khuẩn: Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn khác, gọi là Colicin V. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh.].
- Yếu tố bám dính: Khả năng bám dính của vi khuẩn là yếu tố gây bệnh vô cùng quan trọng để thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh đường ruột, đó là quá trình liên kết vững chắc giữa bề mặt tế bào vi khuẩn và tế bào vật chủ.
Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non. Hầu hết các chủng ETEC đều có mang một hoặc nhiều các yếu tố bám dính như: F4 (K88), F5 (k99), F6 (987P), F17, F18, F41, F42, F165.
Ở nhiều vi khuẩn Gram âm nói chung và vi khuẩn E. coli nói riêng, ngoài lông ra còn có những bộ phận khác hình sợi gọi là pili. Pili hay
Fimbriae có bản chất là protein bao phủ trên toàn bộ bề mặt tế bào vi khuẩn. Dưới kính hiển vi điện tử, chúng có hình ảnh giống 1 chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn. Pili vi khuẩn đường ruột khác lông nó ở chỗ nó cứng hơn, không lượn sóng và không liên quan đến chuyển động của vi khuẩn. Trước đây, kháng nguyên bám dính thường được ký hiệu là K (K88, K99),
nay thay đổi là F (K88 = F4; K99 = F5; 987P = F6). Một số kháng nguyên bám dính chính thường gặp ở các chủng E. coli phân lập từ gia súc bị tiêu chảy bao gồm F4, F5, F6, F18 và F41. Mỗi loại kháng nguyên bám dính có các cấu trúc quyết định kháng nguyên tương xứng, phù hợp với cấu trúc điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào biểu mô nhung mao ruột non của từng loài động vật hoặc từng lứa tuổi.
Về khả năng bám dính, theo Lê Văn Tạo (2006) [13] với các yếu tố gây bệnh có được, trước hết, vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non bằng kháng nguyên bám dính F4 (K88). Sau đó, vi khuẩn xâm nhập và cư trú ở thành ruột non, phát triển nhân lên, sản sinh ra độc tố đường ruột.
Đỗ Ngọc Thúy và cs (2008) [17] cho biết một số yếu tố gây bệnh cơ bản của các chủng E. coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy (1 – 45 ngày) nuôi tại Hưng Yên đã được khảo sát bằng các phản ứng multiplex PCR. Kết quả cho thấy 3 loại độc tố là Sta, STb, LT và 2 loại yếu tố bám dính là F4 và F18 đã được phát hiện trong số 46 chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ các lợn trước và sau khi cai sữa bị tiêu chảy.
- Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E. coli: sau khi bám dính, vi khuẩn sẽ thực hiện quá trình xâm nhập váo sâu bên trong các tế bào. Tại đây, vi khuẩn
E. coli nhân lên với tốc độ lớn đồng thời sản sinh ra độc tố đường ruột, gây phản ứng niêm mạc và đầu độc cơ thể.
Khả năng xâm nhập của vi khuẩn là một khái niệm dùng để chỉ quá trình mà nhờ đó vi khuẩn đường ruột qua được hàng rào bảo vệ của lớp musoca trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Ephithel), đồng thời sản sinh và phát triển trong tế bào này. Trong khi đó, những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp musoca hoặc khi qua được hàng ráo này sẽ bị bắt bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc.
- Độc tố vi khuẩn E. coli: Vi khuẩn E. coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra.
+ Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin): gồm 2 loại:
• Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin – LX): Độc tố này chịu được nhiêt độ 1000C trong vòng 15 phút. Độc tố ST chia thành 2 nhóm Sta và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol. Sta kích thích sản sinh cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na+ và Cl-; làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nước ruột. STb kích thích vòng nucleotid phân tiết dịch độc lập ở ruột, nhưng phương thức tác dụng của STb vẫn chưa được xác định rõ.
• Độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin): Độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút. LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và
LT2, nhưng chỉ có LT1 bị trung hòa bởi Anticholerae toxin. LT là một trong những yếu tố quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy (Fairbrother và cs, 1992) [24]. Cả hai loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở nhiệt độ (-200C).
+ Nhóm độc tố tế bào (Shiga/ Verotoxin):
Theo Clarke và cs (1988) [22]: độc tố tế bào có dạng ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào; có dạng dung giải các không bào nội bào, làm chết tế bào Vera, tế bào Hela và tế bào CHO (Chinese Hansten Ovary Cell).
The Gyles G. L. (1992) [25] đầu tiên người ta nhận thấy E. coli chủng O157: H7 (gây bệnh cho người) sản sinh loại độc tố gọi là Verotoxin, sau này Verotoxin được gọi là Shiga- like toxin (SLT) do chúng giống như độc tố Shiga cả về cấu trúc không gian, trình tự axit amin và phương thức tác động. Cả hai nhóm SLT1 và SLT2 đều có cấu trúc A – B protein, trong đó tiểu phần A ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào. Nhóm SLT2 có hai tác dụng: độc tố đường ruột và độc tố tế bào, SLT sản sinh ở ruột, được hấp thụ vào máu, theo máu đến tác động lên những tế bào ở những bộ phận khác. Ảnh hưởng gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với ảnh hưởng của độc tố đường ruột không chịu nhiệt cổ điển ở nhóm vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC). Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ được sử dụng trước đây. Gần đây, các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này. Stx sản sinh bởi E. coli bao gồm 2 nhóm Stx1 và Stx2.
- Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên:
Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù các vi khuẩn E. coli có nhiều loại kháng nguyên, trong đó, có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của cơ thể vật chủ. Các kháng nguyên tham gia quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K và kháng nguyên F.
- Yếu tố dung huyế (Hly):
Dung huyết là một yếu tố quan trọng để E. coli gây tiêu chảy. Đó là do các chủng E. coli có khả năng sản sinh ra men Haemolyzin để phá hủy hồng cầu của vật chủ, giải phóng Fe+++ dùng cho quá trình phát triển của vi khuẩn. Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E. coli: α – haemolyzin, β – haemolyzin, γ – haemolyzin, ε – haemolyzin, nhưng quan trọng nhất là kiểu α – haemolyzin và β – haemolyzin (Smith H. W. 1963) [28].
Vũ Bình Minh và cs (1999) [8] khi phân lập vi khuẩn E. coli và
mắc bệnh tiêu chảy lứa tuổi từ 35 ngày đến 4 tháng tuổi nuôi tại các địa