2.2.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu ban đầu
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch và sống của mắt ngủ ngồng hoa.
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch và sống của mảnh lá in vivo.
Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch và sống của đầu rễin vivo.
Ngồng hoa, lá non và đầu rễ lan Hồ Điệp được lấy từ vườn vào sáng sớm
được rửa sạch dưới vòi nước, sau đó được lau khô bằng khăn sạch, tiếp theo được khử trùng bằng cồn 700 rồi đưa vào bốc thí nghiệm để xử lí. Sau khi khử trùng ngồng hoa được cắt thành các đoạn 1 cm chứa mắt ngủ; lá non in vivođược cắt nhỏ
thành từng đoạn nhỏ có kích thước 0,5 x 0,5 cm; đầu rễ 0,2cm. Thí nghiệm trên mẫu ngồng hoa,lá non in vivo, đầu rễin vivo với 6 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 10 mẫu/công thức.
+ CT1: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần), ngâm và lắc trong dung dịch JonhSon 1% trong 7 phút. Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu.
+ CT2: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm và lắc trong dung dịch JonhSon 1% trong 10 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu.
+ CT3: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch CaOCl2
15% trong 10 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu.
+ CT4: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch CaOCl2
15% trong 15 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu.
+ CT5: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm và lắc trong dung dịch CaOCl2 15% trong 7 phút. Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm và lắc trong dung dịch JonhSon 1% trong 3 phút. Tráng sạch bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
+ CT6: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch CaOCl2
15% trong 7 phút. Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm và lắc trong dung dịch JonhSon 1% trong 3 phút. Tráng sạch bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu.
Thí nghiệm 1,2,3 được cấy trên môi trường V&W, với 6 công thức khử
trùng, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 10 mẫu/công thức.
2.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy khởi động và thăm dò khả năng phát sinh hình thái của các bộ phận soma.
Thí nghiệm 4. Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của các bộ phận soma khác nhau từ cây in vivo.
CT1: Mắt ngủ ngồng hoa CT2: Mảnh lá in vivo
CT3: Đầu rễin vivo
Thí nghiệm 5. Thăm dò khả năng phát sinh hình thái của mô soma nuôi cấy từ vật liệu khác nhau.
CT1: Mảnh lá in vivo
CT2: Mảnh lá in vitro
CT3: Đầu rễin vivo
CT4: Đầu rễin vitro
Thí nghiệm 4,5 được cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,5mg/l BA (theo Tanaka và cs (1974)), bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 10 mẫu/công thức.
Thí nghiệm 6. Ảnh hưởng của môi trường và trạng thái môi trường đến sự
phát sinh hình thái của ngồng hoa. CT1: Môi trường MS đặc CT2: Môi trường MS lỏng lắc CT3: Môi trường ½ MS đặc CT4: Môi trường ½ MS lỏng lắc CT5: Môi trường VW đặc CT6: Môi trường VW lỏng lắc CT7: Môi trường ½ VW đặc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
CT8: Môi trường ½ VW lỏng lắc
Thí nghiệm trên với 8 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 10 mẫu/công thức.
Thí nghiệm 7. Ảnh hưởng của thời gian cấy chuyển mẫu đến sự phát sinh hình thái của ngồng hoa trong nuôi cấy khởi động.
CT1: 5 ngày cấy chuyển/lần CT2: 10 ngày cấy chuyển/lần CT3: 15 ngày cấy chuyển/lần
Thí nghiệm trên mẫu ngồng hoa với 3 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 10 mẫu/công thức.
2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái từ các bộ phận khác nhau của cây in vitro.
Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của Kinetine (KIN) đến sự phát sinh hình thái từ
mảnh lá của cây in vitro.
Thí nghiệm 9. Ảnh hưởng của Kinetine (KIN) đến sự phát sinh hình thái từ đầu rễ của cây in vitro.
Thí nghiệm 8,9 được cấy trên 6 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 30 mẫu/công thức. CT1(ĐC): Môi trường MS CT2: ĐC + 0,2ppm KIN CT3: ĐC + 0,5ppm KIN CT4: ĐC + 1,0ppm KIN CT5: ĐC + 2,0ppm KIN CT6: ĐC + 3,0ppm KIN
Thí nghiệm 10. Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái từ mảnh lá của cây in vitro.
Thí nghiệm 11. Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái từ đầu rễ của cây in vitro.
Thí nghiệm 10,11 cấy trên 6 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 30 mẫu/công thức.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 CT1(ĐC): Môi trường MS CT2: ĐC + 0,2ppm BA CT3: ĐC + 0,5ppm BA CT4: ĐC + 1,0ppm BA CT5: ĐC + 2,0ppm BA CT6: ĐC + 3,0ppm BA
Thí nghiệm 12. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh hình thái từ mảnh lá của cây in vitro.
Thí nghiệm 13. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh hình thái từđầu rễ của cây in vitro.
Thí nghiệm 12,13 cấy trên 6 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 30 mẫu/công thức. CT1(ĐC): Môi trường MS CT2: ĐC + 0,2ppmIBA CT3: ĐC + 0,5ppm IBA CT4: ĐC + 1,0ppm IBA CT5: ĐC + 2,0ppm IBA CT6: ĐC + 3,0ppm IBA
Thí nghiệm 14. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái từđầu rễ và mảnh lá của cây in vitro. CT1(ĐC): MS CT2: MS +0,2ppm 2,4-D CT3: MS +0,5ppm 2,4-D CT4: MS +1,0ppm 2,4-D CT5: MS +1,5ppm 2,4-D CT6: MS +2,0ppm 2,4-D
Thí nghiệm cấy trên 6 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 30 mẫu/công thức.
2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Nghiên cứu tạo chồi từ protocorm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 từ protocorm. CT1 (ĐC): Môi trường MS CT2: ĐC + 0,2 ppm BA + 0,2 ppm α NAA CT3: ĐC + 0,2 ppm BA + 0,5 ppm α NAA CT4: ĐC + 0,2 ppm BA + 1,0 ppm α NAA CT5: ĐC + 0,5 ppm BA + 0,2 ppm α NAA CT6: ĐC + 0,5 ppm BA + 0,5 ppm α NAA CT7: ĐC + 0,5 ppm BA + 1,0 ppm α NAA CT8: ĐC + 1,0 ppm BA + 0,2 ppm α NAA CT9: ĐC + 1,0 ppm BA + 0,5 ppm α NAA CT10: ĐC + 1,0 ppm BA + 1,0 ppm α NAA
Thí nghiệm trên với 10 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 30 mẫu/công thức.
Thí nghiệm 16. Ảnh hưởng của nước dừa đến tốc độ nuôi lớn chồi lan Hồđiệp. CT1 (ĐC): Môi trường MS
CT2: ĐC + 5% ND CT3: ĐC + 10% ND CT4: ĐC + 15% ND CT5: ĐC + 20% ND
Thí nghiệm cấy trên 5 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 30 mẫu/ công thức.