3.2.1. Thời gian
Tiến hành thí nghiệm từ tháng 11/2012 đến tháng 5/2013.
3.2.2. Địa điểm
- Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học.
3.3. Phƣơng pháp
- Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu đã được phân lập ở Kiên Giang, Trà Vinh bằng cách trồng lúa trên giá thể cát trong dung dịch Yoshida (bảng 3) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng cố định đạm hữu hiệu của các dòng vi khuẩn dựa theo công thức: % 100 (%) kc kc cc TLK TLK TLK E Tên dung dịch Stock
Hóa chất Khối lượng hóa chất để pha Stock (g/1l) Thể tích dung dịch Stock cần cho 1 lít dung dịch (ml) A NH4NO3 91,4 1,25 B NaH2PO4.2H2O 40,3 1,25 C K2SO4 71,4 1,25 D CaCl2 88,6 1,25 E MgSO4.7H2O 324 1,25 F MnCl2.4H2O 1,5 1,25 (NH4)6.Mo7O24.4H2O 0,074 H3BO3 0,934 ZnSO4.7H2O 0,035 CuSO4.5H2O 0,031 FeCl3.6H2O 7,7
Trong đó: E(%): độ hữu hiệu (Effectiveness)
TLKcc: trọng lượng chất khô cây có chủng vi khuẩn. TLKkc: trọng lượng chất khô cây không chủng vi khuẩn. (Theo Nguyễn Hữu Hiệp, 2009)
Bố trí thí nghiệm
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn và thời gian chủng vi khuẩn đến sự sinh trƣởng và phát triển của giống lúa OM6976 trong phòng thí nghiệm.
Thí nghiệm gồm hai nhân tố: dòng vi khuẩn và thời gian chủng, bố trí 36 nghiệm thức (NT), với 3 lần lập lại. Các nghiệm thức sử dụng cát làm giá thể
- NT1- TN3: môi trường Yoshida có bổ sung đạm, không chủng vi khuẩn, làm đối chứng dương.
- NT4- TN6: môi trường Yoshida không bổ sung đạm, không chủng vi khuẩn, làm đối chứng âm
- NT7 – NT16 : môi trường Yoshida không bổ sung đạm, chủng 10 dòng vi khuẩn, thời gian chủng vi khuẩn 1 giờ.
- NT17 – NT26: môi trường Yoshida không bổ sung đạm, chủng 10 dòng vi khuẩn, thời gian chủng vi khuẩn 2 giờ.
- NT27 – NT36: môi trường Yoshida không bổ sung đạm, chủng 10 dòng vi khuẩn,thời gian chủng vi khuẩn 3 giờ.
Bảng 4. Các nghiệm thức trong thí nghiệm 1
Nghiệm thức Môi trường Yoshida
Giá thể Chủng vi khuẩn Thời gian chủng vi khuẩn NT1- NT3 Có đạm Cát Không có - NT4 – NT6 Không đạm Cát Không có - NT7 – NT16 Không đạm Cát 10 DÒNG VK 1 giờ NT17 – NT26 Không đạm Cát 10 DÒNG VK 2 giờ NT27 – NT36 Không đạm Cát 10 DÒNG VK 3 giờ
Quy trình thực hiện:
- Chuẩn bị dụng cụ và môi trường:
Chuẩn bị bình tam giác, bình nuôi cấy lúa.
Chuẩn bị môi trường ươm hạt giống : 72 bình môi trường, mỗi bình 0,2g agar + 40 ml nước cất, khử trùng.
Chuẩn bị môi trường Yoshida: pha 12 lít môi trường Yoshida không đạm (không bổ sung NH4NO3) và 1,5 lít môi trường Yoshida có đạm, cho 40 ml dung dịch môi trường vào bình tam giác như bảng 2.
-Chuẩn bị môi trường Burk’s để nuôi tăng sinh vi khuẩn: chuẩn bị 2 lít môi trường Burk’s, cho vào 90 ống fancon, mỗi ống 20ml dung dịch môi trường.
- Khử trùng môi trường ươm hạt giống, môi trường Yoshisa, môi trường Burk’s ở 1210
C trong 30 phút.
- Chuẩn bị hạt lúa giống OM6976: chọn những hạt giống chắc hạt, sáng. Cho vào bình tam giác 500ml đã được khử trùng trước, khử trùng hạt giống bằng cồn 700
. Sau đó ngâm với nước Javel và lắc bằng máy khuấy từ trong 30 phút. Sử dụng nước cất đã khử trùng rửa lại hạt lúa nhiều lần cho sạch nước Javel (thao tác trong tủ cấy vô trùng). Tiến hành gieo hạt lúa vào 72 bình môi trường ươm hạt đã chuẩn bị trước, mỗi bình 30 – 35 hạt, ủ trong tủ tối 30 – 320C trong 2 ngày, sau đó đem ra ngoài cho mạ phát triển bình thường.
- Chuẩn bị vi khuẩn: 10 dòng vi khuẩn cố định đạm đã được phân lập cấy vào môi trường Burk’s đã khử trùng, sau đó đặt vào máy lắc ở 300
C trong 4 ngày.
- Chủng vi khuẩn: mạ sau 4 ngày cao khoảng 2 – 3 cm thì tiến hành chủng vi khuẩn vào cây mạ bằng cách ngâm cây mạ trong dung dịch chứa vi khuẩn ở các mức thời gian 1giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó cấy vào các bình tam giác theo các nghiệm thức khác nhau, mỗi bình 3 cây. Khi cấy xong, đặt các bình tam giác dưới áng sáng đèn cho phát triển bình thường, theo dõi kết quả sau 20 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: số lượng lá (số lá trên một cây), chiều dài rễ (tính từ gốc rễ đến rễ dài nhất, số rễ (số rễ trên một cây), trọng lượng tươi (là trọng lượng của một cây khi còn tươi), trọng lượng khô (là trọng lượng của một cây sau khi sấy khô).
3.3.2. Khảo sát tƣơng tác của các giống lúa chịu mặn và các dòng vi khuẩn có
khả năng cố định đạm phân lập từ đất nhiễm mặn. a. Vật liệu
Bộ giống lúa chịu mặn và các dòng vi khuẩn cho kết cao ở thí nghiệm 1
b. Tiến hành
Thí nghiệm thực hiện với hai nhân tố dòng vi khuẩn và giống lúa. Thí nghiệm gồm 36 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. Các nghiệm thức sử dụng cát làm giá thể và dung dịch Yoshida có độ mặn 4‰.
Bảng 5. Các nghiệm thức trong thí nghiệm 2
NGHIỆM THỨC
GIỐNG LÚA MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN
NT1 – NT6 6 giống lúa Có đạm Không
NT7 – NT12 6 giống lúa Không đạm Không
NT13 – NT36 6 giống lúa Không đạm Chủng bốn dòng vi khuẩn
Quy trình thực hiện:
- Chuẩn bị dụng cụ và môi trường:
Chuẩn bị bình tam giác, bình nuôi cấy lúa.
Chuẩn bị môi trường ươm hạt giống : 12 bình môi trường, mỗi bình 0,2g agar + 40 ml nước cất, khử trùng.
Chuẩn bị môi trường Yoshida: pha môi trường Yoshida không đạm (không bổ sung NH4NO3) và môi trường Yoshida có đạm có độ mặn 4‰, cho 40 ml dung dịch môi trường vào bình tam giác bố trí thí nghiệm trên.
-Chuẩn bị môi trường Burk’s để nuôi tăng sinh vi khuẩn: chuẩn bị 1 lít môi trường Burk’s cho vào 48 ống fancon, mỗi ống chứa 20ml dung dịch môi trường.
- Khử trùng môi trường ươm hạt giống, môi trường Yoshida, môi trường Burk’s ở 1210
- Chuẩn bị lúa giống OM6976, OM5629, OM9584, OM5464, OM9915, AS996 : chọn những hạt giống chắc hạt, sáng. Cho vào bình tam giác 500ml đã được khử trùng trước, khử trùng hạt giống bằng cồn 700
. Sau đó ngâm với nước Javel và lắc trong 30 phút. Sử dụng nước cất đã khử trùng rửa lại hạt lúa nhiều lần cho sạch nước Javel (thao tác trong tủ cấy vô trùng). Tiến hành gieo hạt lúa vào 12 bình môi trường ươm hạt đã chuẩn bị trước, mỗi bình 30 – 35 hạt, ủ trong tủ tối 30 – 320C trong 2 ngày, sau đó đem ra ngoài cho mạ phát triển bình thường.
- Chuẩn bị vi khuẩn: các dòng vi khuẩn SO18, DH23, TVT2, KG2KG7 cho vào môi trường Burk’s đã khử trùng, sau đó đặt vào máy lắc ở 300
C trong khoảng 4 ngày.
- Chủng vi khuẩn: mạ sau 4 ngày cao khoảng 2 – 3 cm thì tiến hành chủng vi khuẩn vào cây mạ bằng cách ngâm cây mạ trong dung dịch chứa vi khuẩn ở mức thời gian cho kết quả cao nhất ở thí nghiệm 1. Sau đó cấy vào các bình tam giác theo các nghiệm thức khác nhau, mỗi bình 3 cây. Khi cấy xong, đặt các bình tam giác dưới áng sáng đèn cho phát triển bình thường, theo dõi kết quả sau 30 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: số lượng lá (số lá trên một cây), chiều dài rễ (tính từ gốc rễ đến rễ dài nhất, số rễ (số rễ trên một cây), trọng lượng tươi (là trọng lượng của một cây khi còn tươi), trọng lượng khô (là trọng lượng của một cây sau khi được sấy khô 650
C trong 72 giờ).
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến sinh trƣởng và phát triển của giống lúa OM6976 ở điều kiện phòng thí nghiệm. trƣởng và phát triển của giống lúa OM6976 ở điều kiện phòng thí nghiệm.
4.1.1. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến các chỉ tiêu sinh trƣởng.
Mười dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao được phân lập ở hai tỉnh Kiên Giang và Trà Vinh DH23, SO18, DH13a, TVT2, TV2, KG1KG2, KG2KG7, KG5, KG22b, RG2KH, được bố trí thí nghiệm nhằm khảo sát khả năng cố định đạm hữu hiệu của các dòng vi khuẩn cố định đạm đến các chỉ tiêu sinh trưởng của giống lúa OM6976 bằng cách trồng lúa trên giá thể cát có bổ môi trường Yoshida (bảng 2). Kết quả thu được sau 20 ngày và được phân tích thống kê bằng phần mềm Statgaphics 3.0.
Tổng quan cho thấy có sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn và thời gian ngâm mầm cây ở nhiều chỉ tiêu khảo sát.
4.1.1.1 Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến chỉ tiêu chiều cao cây.
Kết quả cho thấy dòng SO18 cho giá trị cao nhất, trung bình 24,17cm, khác biệt không có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn khác và DC dương nhưng lại có khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với dòng KG2KG7 và DC âm. DC âm cho kết quả trung bình thấp nhất 19,02cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với các dòng vi khuẩn. Xét từng mức thời gian ngâm, dòng SO18 cho kết quả cao nhất khi ngâm một giờ và hai giờ, trung bình lần lượt là 26,45cm và 24,15cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với nghiệm thức DC âm, khi ngâm ở ba giờ dòng KG22b lại cho kết quả cao nhất, trung bình 25,24cm, khác biệt không có ý nghĩa so với dòng SO18, nhưng khác biệt có ý nghĩa 5% so với DC âm. Nhìn chung ở chỉ tiêu chiều cao cây, các dòng vi khuẩn khác nhau có tác động và làm khác biệt về chiều cao giống lúa OM 6976 ở mức 5%. Thời gian ngâm mầm cây trong dịch vi khuẩn tác động không có ý nghĩa đến chiều cao cây lúa ở các nghiệm thức khảo sát. Sự tương tác giữa dòng vi khuẩn và thời gian ngâm là không có ý nghĩa về mặc thống kê (Bảng 6).
Bảng 6. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn và thời gian ngâm đến chỉ tiêu chiều cao cây của giống lúa OM6976 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Ghi chú
Các giá trị trong một cột, hàng đi theo sau cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê 5%
Dòng vi khuẩn Thời gian ngâm 1h Thời gian ngâm 2h Thời gian ngâm 3h Trung bình
DH23 24,9abc 23,95a-f 21,68b-g 23,51ab
DH13a 24,20abcde 22,73a-g 21,95b-g 22,96ab
SO18 26,45a 24,15abcde 21,91b-g 24,17a
TV2 23,27a-f 19,53gh 22,53a-g 21,78ab
TVT2 20,78c-h 23,25a-g 22,42a-g 22,21ab
KG1KG2 19,75fgh 21,91b-g 23,81a-g 21,82ab
KG2KG7 19,55fgh 21,69b-g 23,18a-g 21,47bc
KG22b 20,49defgh 23,02a-g 25,24ab 22,91ab
KG5 21,32b-g 21,90b-g 22,36a-g 21,86ab
RG2KG 20,78c-h 22,47a-g 25,12abc 22,79ab
DC dương 24,55abcd 20,26defgh 24,55abcd 23,12ab
DC âm 20,17defgh 16,76h 20,13efgh 19,02c
Trung bình 22,20a 21,80a 22,91a
Nhân tố P-value F-ratio CV (%)
Dòng vi khuẩn 0,0304 2,11 11,04
Thời gian ngâm 0,2212 1,54
4.1.1.2 Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến chỉ tiêu chiều dài rễ.
Chiều dài rễ ảnh hưởng đến khả năng chống chịu và tìm nguồn dinh dưỡng cho cây. Theo kết quả cho thấy dòng RG2KG cho kết quả tốt nhất, trung bình 12,43cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với hai đối chứng và các dòng vi khuẩn (trừ KG1KG2 và KG22b), DC âm cho kết quả thấp nhất, trung bình 6,11cm. Dòng vi khuẩn RG2KG cho kết quả tốt nhất khi ngâm trong thời gian một giờ và hai giờ, trung bình lần lượt là 10,06cm và 15,86cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với hai đối chứng, khi ngâm ba giờ dòng KG22b lại cho kết quả cao nhất, trung bình 14,66cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với hai đối chứng. Thời gian ngâm mầm cây trong dịch vi khuẩn tác động không có ý nghĩa đến chiều dài rễ cây lúa ở các nghiệm thức khảo sát. Sự tương tác giữa dòng vi khuẩn và thời gian ngâm khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% (Bảng 7).
Bảng 7. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn và thời gian ngâm đến chỉ tiêu chiều dài rễ của giống lúa OM6976 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Dòng vi khuẩn Thời gian ngâm 1h Thời gian ngâm 2h Thời gian ngâm 3h Trung bình
DH23 8,76fghi 6,71klmn 6,67klmn 7,38e
DH13a 6,57klmn 8,06hijkl 6,82ijklmn 7,15e
SO18 8,68fghij 7,84hijklm 6,64klmn 7,72de
TV2 8,23ghijk 5,48n 6,45klmn 6,72e
TVT2 6,66klmn 6,34klmn 6,95ijklmn 6,65e
KG1KG2 8,12ghijk 13,17bcd 13,96abc 11,75ab
KG2KG7 7,70hijklm 7,45ijklmn 13,03bcd 9,39cd
KG22b 7,60ijklm 10,47ef 14,66ab 10,91abc
KG5 7,98hijkl 9,60efgh 12,64cd 10,07bc
RG2KG 10,06efg 15,86a 11,35de 12,43a
DC dương 7,68hijklm 6,11lmn 6,91ijklmn 6,90e
Ghi chú
Các giá trị trong một cột, hàng đi theo sau cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê 5%
4.1.1.3 Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến chỉ tiêu số rễ.
Số rễ ảnh hưởng đến khả năng hút nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng. Kết quả khảo sát chỉ tiêu số rễ giữa các dòng vi khuẩn không có sự chênh lệch rõ rệt trung bình số rễ dao động từ 5,29 đến 7,94 rễ/cây. Theo kết quả cho thấy dòng vi khuẩn DH23 có số rễ cao nhất, trung bình 7,94 rễ/cây, khác biệt có ý nghĩa 5% so với hai đối chứng, DC âm có kết quả thấp nhất (trung bình 5,29 rễ/cây). Hai dòng vi khuẩn SO18, TVT2 cho chỉ tiêu số lượng rễ trung bình/cây dao động từ 7,72 đến 7,90 rễ/cây, khác biệt ý nghĩa ở mức 5% so với DC dương. Xét kết quả ở từng mức thời gian, dòng SO18 cho kết quả cao nhất khi ngâm ở một giờ và hai giờ, trung bình lần lượt là 8,05 và 8,33 rễ/cây, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với đối chứng âm, dòng KG5 lại cho kết quả cao nhất khi ngâm ở ba giờ, trung bình 8,39 rễ/cây, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với hai đối chứng. Theo bảng 8 cho thấy thời gian ngâm mầm cây cho kết quả khác biệt nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê.
Bảng 8. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn và thời gian ngâm đến chỉ tiêu số rễ của giống lúa OM6976 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Dòng vi khuẩn Thời gian ngâm 1h Thời gian ngâm 2h Thời gian ngâm 3h Trung bình
DH23 7,66abcd 8,16abc 8,00abc 7,94a
DH13a 6,77b-g 8,16abc 6,78b-h 7,24abc
SO18 8,05abc 8,33ab 7,33abcde 7,90a
TV2 6,77b-h 5,83e-j 7,33abcde 6,62cd
TVT2 7,223a-f 7,943abcd 8,00abc 7,72ab
Trung bình 8,23b 8,58ab 9,35a
Nhân tố P-value F-ratio CV (%)
Dòng vi khuẩn 0,0000 11,73 11,58
Thời gian ngâm 0,0515 3,06
KG1KG2 5,33hij 7,00a-g 6,05e-j 6,13de
KG2KG7 7,00a-g 6,72c-h 7,33abcde 7,01abcd
KG22b 5,66fghij 6,66c-h 7,776abcd 6,70bcd
KG5 7,66abcd 4,66j 8,39a 6,90abcd
RG2KG 7,33abcde 5,55ghij 6,77b-h 6,55cd
DC dương 5,833e-j 7,00a-g 6,39defgh 6,40cd
DC âm 5,05ij 6,00e-j 4,83ij 5,29e
Trung bình 6,67a 6,72a 6,96a
Nhân tố P-value F-ratio CV (%)
Dòng vi khuẩn 0,0001 4,17 12,58
Thời gian ngâm 0,3582 1,04
Tương tác 0,0023 2,45
Ghi chú
Các giá trị trong một cột, hàng đi theo sau cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống 5%.
4.1.1.4 Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến chỉ tiêu trọng lƣợng khô.
Chỉ tiêu trọng lượng khô được xem là chỉ tiêu quan trọng nhất khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đạm đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Đạm là nhân tố cấu thành nên protein cũng như là thành phần chính của chất hữu cơ trong cây. Qua kết quả bảng 9 cho thấy 4 dòng vi khuẩn là SO18, DH23, TVT2, KG2KG7 cho kết quả cao nhất, (từ 0,0774- 0,0832g) thấp hơn so với DC dương nhưng khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này cho thấy hàm lượng đạm cung cấp từ các dòng vi khuẩn này vẫn đảm bảo cho cây lúa sinh trưởng và phát triển ở giai đoạn 20 ngày khảo sát. Các dòng vi khuẩn còn lại hàm lượng chất khô mặc dù thấp hơn so với đối chứng