Cheng - Hui Xie và Akira Yokota năm 2005 đã phân lập vi khuẩn cố định đạm
Azospirillum oryzae sp.nov. từ rễ lúa Oryza sativa.
Tejera et al., (2005) đã nghiên cứu đặc tính và phân lập các dòng vi khuẩn
Azotobacter và Azospirillum từ vùng rễ cây mía ở Tây Ban Nha nhận thấy
Azospirillum có khả năng kết hợp tốt với vùng rễ cây mía đường hơn so với
Azotobacter.
Jadav et al., (2010) thực hiện nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn có mặt tại vùng rễ như Pseudomonas aeruginosa BHUPSB02, Pseudomonas putida BHUPSB04,
Bacillus subtilis BHUPSB13, Paenibacillus polymyxa BHUPSB17 và Bacillus boronophilus BHUPSB19 có khả năng cải thiện khả năng nảy mầm của hạt đậu garbanzo (Cicer arietinum L.).
Venieraki et al., (2011) nghiên cứu đặc tính của các dòng vi khuẩn cố định đạm được phân lập từ vùng rễ lúa mạch, yến mạch, lúa mì.
Venieraki et al., (2011) khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm phân lập từ rễ lúa mì. Phân lập được 17 dòng vi khuẩn cố định đạm từ rễ lúa mì.
2.4.2. Trong nƣớc
Ở Việt Nam, có những nghiên cứu rất sớm về vi khuẩn cố định đạm như vi khuẩn nốt rễ cho cây đậu (Trần Phước Đường et al., 1984) và luân canh đậu - lúa (Trần Phước Đường et al., 1999) nhưng nghiên cứu về vi khuẩn sống trong rễ lúa chỉ có những nghiên cứu của Gillis và đồng tác giả (1995) phát hiện vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis sống trong rễ lúa trồng ở Việt Nam. Sau đó, các nhà khoa học đã xác định được Burkholderia vietnamiensis là loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm giúp tăng năng suất lúa (Trần Văn Vân et al., 2000), tăng năng suất mía (Baldani et al., 2002).
Cao Ngọc Điệp (2005) “Hiệu quả của chủng vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn Pseudomonas spp. trên đậu nành”. Một thí nghiệm nhằm khảo sát hiệu quả của việc chủng vi khuẩn nốt rễ và vi khuẩn Pseudomonas spp. trên sự phát triển đậu nành (giống Nhật Bản 17A). Kết quả cho thấy thành phần năng suất, năng suất hột và hàm lượng protein trong hột đậu nành gia tăng đáng kể khi tưới dịch lên men vi khuẩn Pseudomonas spp. so với nghiệm thức không tưới dịch. Chủng hột đậu nành với vi khuẩn nốt rễ (dòng VN082 hay dòng ĐH-2) kết hợp với dịch lên men vi khuẩn Pseudomonas spp. cho năng suất hột cao nhất và chất lượng hột đậu nành tốt nhất.
Nguyễn Hữu Hiệp et al., (2005) đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn có các đặc tính giống như giống Azospirillum trên cây lúa và nhận diện 8 dòng trong số đó là
Azospirillum lipoferum bằng kỹ thuật PCR.
Ngô Thanh Phong et al., (2010) phân lập và nhận diện vi khuẩn cố định đạm trong đất vùng rễ lúa trồng trên đất phù sa tỉnh Kiên Giang. Năm mươi mốt dòng vi khuẩn cố định đạm được phân lập trong đó có 34/51 có khả năng cố định đạm cao.
Ngô Thanh Phong et al., (2011) phân lập và nhận diện vi khuẩn cố định đạm trong đất vùng rễ lúa trồng trên đất phù sa tỉnh Vĩnh Long. Bảy mươi chủng vi khuẩn
được phân lập từ 27 mẫu đất trồng lúa của 3 huyện (Tam Bình, Trà Ôn và Vũng Liêm) của tỉnh Vĩnh Long trong đó có 59 chủng có khả năng cố định đạm. Mười chủng có khả năng khử acetylene (ARA). Có 21 chủng trong 25 chủng vi khuẩn có băng tương ứng 475bp trong phổ điện di của các phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen
nifPolR và PolF.
Nguyễn Lam Anh (2012) phân lập từ vùng đất rễ lúa của 3 huyện thuộc tỉnh Đồng Tháp: Hồng Ngự, Thanh Bình, Tam Nông, được 41 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm (Hồng Ngự: 7 dòng, Thanh Bình: 1 dòng, Tam Nông: 23 dòng).
Võ Long Duyên (2012) khảo sát ảnh hưởng một số vi khuẩn có khả năng cố định đạm đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lúa OM6976. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, dụng cụ.
3.1.1. Vật liệu
- Giống lúa OM6976, OM5629, OM9584, OM5464, OM9915, AS996.
- Các dòng vi khuẩn cố định đạm cao được phân lập tại Kiên Giang, Trà Vinh (Bảng 1)
3.1.2. Dụng cụ, hóa chất
- Bình tam giác, tủ cấy vô trùng, tủ ủ, máy đo pH, cân điện tử, máy khuấy từ, - Đĩa petri, kim cấy vi sinh vật, kẹp, đèn cồn.
- Micropipet, tube, các loại đầu côn. - Nồi khử trùng nhiệt ướt.
- Một số hóa chất.
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng Burk’s không đạm (Park et al., 2005) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Hóa chất Nồng độ 1 Sucrose 10g 2 KH2PO4 0,41g 3 K2HPO4 0,52g 4 Na2SO4 0,05g 5 CaCl2. 2H2O 0,26g 6 MgSO4. 7H2O 0,1g 7 FeSO4. 7H2O 0,005g 8 NaMoO4. 2H2O 0,0025g
Bảng 3. Thành phần dung dịch Yoshida pH = 5 (Yoshida et al., 1976)
3.2. Thời gian, địa điểm thí nghiệm3.2.1. Thời gian 3.2.1. Thời gian
Tiến hành thí nghiệm từ tháng 11/2012 đến tháng 5/2013.
3.2.2. Địa điểm
- Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học.
3.3. Phƣơng pháp
- Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu đã được phân lập ở Kiên Giang, Trà Vinh bằng cách trồng lúa trên giá thể cát trong dung dịch Yoshida (bảng 3) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng cố định đạm hữu hiệu của các dòng vi khuẩn dựa theo công thức: % 100 (%) kc kc cc TLK TLK TLK E Tên dung dịch Stock
Hóa chất Khối lượng hóa chất để pha Stock (g/1l) Thể tích dung dịch Stock cần cho 1 lít dung dịch (ml) A NH4NO3 91,4 1,25 B NaH2PO4.2H2O 40,3 1,25 C K2SO4 71,4 1,25 D CaCl2 88,6 1,25 E MgSO4.7H2O 324 1,25 F MnCl2.4H2O 1,5 1,25 (NH4)6.Mo7O24.4H2O 0,074 H3BO3 0,934 ZnSO4.7H2O 0,035 CuSO4.5H2O 0,031 FeCl3.6H2O 7,7
Trong đó: E(%): độ hữu hiệu (Effectiveness)
TLKcc: trọng lượng chất khô cây có chủng vi khuẩn. TLKkc: trọng lượng chất khô cây không chủng vi khuẩn. (Theo Nguyễn Hữu Hiệp, 2009)
Bố trí thí nghiệm
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn và thời gian chủng vi khuẩn đến sự sinh trƣởng và phát triển của giống lúa OM6976 trong phòng thí nghiệm.
Thí nghiệm gồm hai nhân tố: dòng vi khuẩn và thời gian chủng, bố trí 36 nghiệm thức (NT), với 3 lần lập lại. Các nghiệm thức sử dụng cát làm giá thể
- NT1- TN3: môi trường Yoshida có bổ sung đạm, không chủng vi khuẩn, làm đối chứng dương.
- NT4- TN6: môi trường Yoshida không bổ sung đạm, không chủng vi khuẩn, làm đối chứng âm
- NT7 – NT16 : môi trường Yoshida không bổ sung đạm, chủng 10 dòng vi khuẩn, thời gian chủng vi khuẩn 1 giờ.
- NT17 – NT26: môi trường Yoshida không bổ sung đạm, chủng 10 dòng vi khuẩn, thời gian chủng vi khuẩn 2 giờ.
- NT27 – NT36: môi trường Yoshida không bổ sung đạm, chủng 10 dòng vi khuẩn,thời gian chủng vi khuẩn 3 giờ.
Bảng 4. Các nghiệm thức trong thí nghiệm 1
Nghiệm thức Môi trường Yoshida
Giá thể Chủng vi khuẩn Thời gian chủng vi khuẩn NT1- NT3 Có đạm Cát Không có - NT4 – NT6 Không đạm Cát Không có - NT7 – NT16 Không đạm Cát 10 DÒNG VK 1 giờ NT17 – NT26 Không đạm Cát 10 DÒNG VK 2 giờ NT27 – NT36 Không đạm Cát 10 DÒNG VK 3 giờ
Quy trình thực hiện:
- Chuẩn bị dụng cụ và môi trường:
Chuẩn bị bình tam giác, bình nuôi cấy lúa.
Chuẩn bị môi trường ươm hạt giống : 72 bình môi trường, mỗi bình 0,2g agar + 40 ml nước cất, khử trùng.
Chuẩn bị môi trường Yoshida: pha 12 lít môi trường Yoshida không đạm (không bổ sung NH4NO3) và 1,5 lít môi trường Yoshida có đạm, cho 40 ml dung dịch môi trường vào bình tam giác như bảng 2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Chuẩn bị môi trường Burk’s để nuôi tăng sinh vi khuẩn: chuẩn bị 2 lít môi trường Burk’s, cho vào 90 ống fancon, mỗi ống 20ml dung dịch môi trường.
- Khử trùng môi trường ươm hạt giống, môi trường Yoshisa, môi trường Burk’s ở 1210
C trong 30 phút.
- Chuẩn bị hạt lúa giống OM6976: chọn những hạt giống chắc hạt, sáng. Cho vào bình tam giác 500ml đã được khử trùng trước, khử trùng hạt giống bằng cồn 700
. Sau đó ngâm với nước Javel và lắc bằng máy khuấy từ trong 30 phút. Sử dụng nước cất đã khử trùng rửa lại hạt lúa nhiều lần cho sạch nước Javel (thao tác trong tủ cấy vô trùng). Tiến hành gieo hạt lúa vào 72 bình môi trường ươm hạt đã chuẩn bị trước, mỗi bình 30 – 35 hạt, ủ trong tủ tối 30 – 320C trong 2 ngày, sau đó đem ra ngoài cho mạ phát triển bình thường.
- Chuẩn bị vi khuẩn: 10 dòng vi khuẩn cố định đạm đã được phân lập cấy vào môi trường Burk’s đã khử trùng, sau đó đặt vào máy lắc ở 300
C trong 4 ngày.
- Chủng vi khuẩn: mạ sau 4 ngày cao khoảng 2 – 3 cm thì tiến hành chủng vi khuẩn vào cây mạ bằng cách ngâm cây mạ trong dung dịch chứa vi khuẩn ở các mức thời gian 1giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó cấy vào các bình tam giác theo các nghiệm thức khác nhau, mỗi bình 3 cây. Khi cấy xong, đặt các bình tam giác dưới áng sáng đèn cho phát triển bình thường, theo dõi kết quả sau 20 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: số lượng lá (số lá trên một cây), chiều dài rễ (tính từ gốc rễ đến rễ dài nhất, số rễ (số rễ trên một cây), trọng lượng tươi (là trọng lượng của một cây khi còn tươi), trọng lượng khô (là trọng lượng của một cây sau khi sấy khô).
3.3.2. Khảo sát tƣơng tác của các giống lúa chịu mặn và các dòng vi khuẩn có
khả năng cố định đạm phân lập từ đất nhiễm mặn. a. Vật liệu
Bộ giống lúa chịu mặn và các dòng vi khuẩn cho kết cao ở thí nghiệm 1
b. Tiến hành
Thí nghiệm thực hiện với hai nhân tố dòng vi khuẩn và giống lúa. Thí nghiệm gồm 36 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. Các nghiệm thức sử dụng cát làm giá thể và dung dịch Yoshida có độ mặn 4‰.
Bảng 5. Các nghiệm thức trong thí nghiệm 2
NGHIỆM THỨC
GIỐNG LÚA MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN
NT1 – NT6 6 giống lúa Có đạm Không
NT7 – NT12 6 giống lúa Không đạm Không
NT13 – NT36 6 giống lúa Không đạm Chủng bốn dòng vi khuẩn
Quy trình thực hiện:
- Chuẩn bị dụng cụ và môi trường:
Chuẩn bị bình tam giác, bình nuôi cấy lúa.
Chuẩn bị môi trường ươm hạt giống : 12 bình môi trường, mỗi bình 0,2g agar + 40 ml nước cất, khử trùng.
Chuẩn bị môi trường Yoshida: pha môi trường Yoshida không đạm (không bổ sung NH4NO3) và môi trường Yoshida có đạm có độ mặn 4‰, cho 40 ml dung dịch môi trường vào bình tam giác bố trí thí nghiệm trên.
-Chuẩn bị môi trường Burk’s để nuôi tăng sinh vi khuẩn: chuẩn bị 1 lít môi trường Burk’s cho vào 48 ống fancon, mỗi ống chứa 20ml dung dịch môi trường.
- Khử trùng môi trường ươm hạt giống, môi trường Yoshida, môi trường Burk’s ở 1210
- Chuẩn bị lúa giống OM6976, OM5629, OM9584, OM5464, OM9915, AS996 : chọn những hạt giống chắc hạt, sáng. Cho vào bình tam giác 500ml đã được khử trùng trước, khử trùng hạt giống bằng cồn 700
. Sau đó ngâm với nước Javel và lắc trong 30 phút. Sử dụng nước cất đã khử trùng rửa lại hạt lúa nhiều lần cho sạch nước Javel (thao tác trong tủ cấy vô trùng). Tiến hành gieo hạt lúa vào 12 bình môi trường ươm hạt đã chuẩn bị trước, mỗi bình 30 – 35 hạt, ủ trong tủ tối 30 – 320C trong 2 ngày, sau đó đem ra ngoài cho mạ phát triển bình thường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị vi khuẩn: các dòng vi khuẩn SO18, DH23, TVT2, KG2KG7 cho vào môi trường Burk’s đã khử trùng, sau đó đặt vào máy lắc ở 300
C trong khoảng 4 ngày.
- Chủng vi khuẩn: mạ sau 4 ngày cao khoảng 2 – 3 cm thì tiến hành chủng vi khuẩn vào cây mạ bằng cách ngâm cây mạ trong dung dịch chứa vi khuẩn ở mức thời gian cho kết quả cao nhất ở thí nghiệm 1. Sau đó cấy vào các bình tam giác theo các nghiệm thức khác nhau, mỗi bình 3 cây. Khi cấy xong, đặt các bình tam giác dưới áng sáng đèn cho phát triển bình thường, theo dõi kết quả sau 30 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: số lượng lá (số lá trên một cây), chiều dài rễ (tính từ gốc rễ đến rễ dài nhất, số rễ (số rễ trên một cây), trọng lượng tươi (là trọng lượng của một cây khi còn tươi), trọng lượng khô (là trọng lượng của một cây sau khi được sấy khô 650
C trong 72 giờ).
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến sinh trƣởng và phát triển của giống lúa OM6976 ở điều kiện phòng thí nghiệm. trƣởng và phát triển của giống lúa OM6976 ở điều kiện phòng thí nghiệm.
4.1.1. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến các chỉ tiêu sinh trƣởng.
Mười dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao được phân lập ở hai tỉnh Kiên Giang và Trà Vinh DH23, SO18, DH13a, TVT2, TV2, KG1KG2, KG2KG7, KG5, KG22b, RG2KH, được bố trí thí nghiệm nhằm khảo sát khả năng cố định đạm hữu hiệu của các dòng vi khuẩn cố định đạm đến các chỉ tiêu sinh trưởng của giống lúa OM6976 bằng cách trồng lúa trên giá thể cát có bổ môi trường Yoshida (bảng 2). Kết quả thu được sau 20 ngày và được phân tích thống kê bằng phần mềm Statgaphics 3.0.
Tổng quan cho thấy có sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn và thời gian ngâm mầm cây ở nhiều chỉ tiêu khảo sát.
4.1.1.1 Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến chỉ tiêu chiều cao cây.
Kết quả cho thấy dòng SO18 cho giá trị cao nhất, trung bình 24,17cm, khác biệt không có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn khác và DC dương nhưng lại có khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với dòng KG2KG7 và DC âm. DC âm cho kết quả trung bình thấp nhất 19,02cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với các dòng vi khuẩn. Xét từng mức thời gian ngâm, dòng SO18 cho kết quả cao nhất khi ngâm một giờ và hai giờ, trung bình lần lượt là 26,45cm và 24,15cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với nghiệm thức DC âm, khi ngâm ở ba giờ dòng KG22b lại cho kết quả cao nhất, trung bình 25,24cm, khác biệt không có ý nghĩa so với dòng SO18, nhưng khác biệt có ý nghĩa 5% so với DC âm. Nhìn chung ở chỉ tiêu chiều cao cây, các dòng vi khuẩn khác nhau có tác động và làm khác biệt về chiều cao giống lúa OM 6976 ở mức 5%. Thời gian ngâm mầm cây trong dịch vi khuẩn tác động không có ý nghĩa đến chiều cao cây lúa ở các nghiệm thức khảo sát. Sự tương tác giữa dòng vi khuẩn và thời gian ngâm là không có ý nghĩa về mặc thống kê (Bảng 6).
Bảng 6. Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn và thời gian ngâm đến chỉ tiêu chiều cao cây của giống lúa OM6976 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Ghi chú
Các giá trị trong một cột, hàng đi theo sau cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê 5%
Dòng vi khuẩn Thời gian ngâm 1h Thời gian ngâm 2h Thời gian ngâm 3h Trung bình
DH23 24,9abc 23,95a-f 21,68b-g 23,51ab
DH13a 24,20abcde 22,73a-g 21,95b-g 22,96ab
SO18 26,45a 24,15abcde 21,91b-g 24,17a
TV2 23,27a-f 19,53gh 22,53a-g 21,78ab
TVT2 20,78c-h 23,25a-g 22,42a-g 22,21ab
KG1KG2 19,75fgh 21,91b-g 23,81a-g 21,82ab
KG2KG7 19,55fgh 21,69b-g 23,18a-g 21,47bc
KG22b 20,49defgh 23,02a-g 25,24ab 22,91ab
KG5 21,32b-g 21,90b-g 22,36a-g 21,86ab
RG2KG 20,78c-h 22,47a-g 25,12abc 22,79ab
DC dương 24,55abcd 20,26defgh 24,55abcd 23,12ab
DC âm 20,17defgh 16,76h 20,13efgh 19,02c
Trung bình 22,20a 21,80a 22,91a (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhân tố P-value F-ratio CV (%)
Dòng vi khuẩn 0,0304 2,11 11,04
Thời gian ngâm 0,2212 1,54
4.1.1.2 Ảnh hƣởng của các dòng vi khuẩn cố định đạm và thời gian ngâm đến chỉ tiêu chiều dài rễ.
Chiều dài rễ ảnh hưởng đến khả năng chống chịu và tìm nguồn dinh dưỡng cho cây. Theo kết quả cho thấy dòng RG2KG cho kết quả tốt nhất, trung bình 12,43cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với hai đối chứng và các dòng vi khuẩn (trừ