nghiệm
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của cao chiết ban di thực đến các thông số sinh hóa đánh giá chức năng gan của thỏ thí nghiệm
Các thông số sinh hóa Trƣớc khi dùng thuốc Sau khi dùng thuốc 15 ngày Sau khi dùng thuốc 30 ngày ALAT (U/l) Lô chứng 39,12 ± 1,28 47,99 ± 10,28 41,12 ± 3,14 Lô thử 1 37,75 ± 3,38 45,97 ± 7,08 49,14 ± 6,88 Lô thử 2 39,24 ± 1,67 44,11 ± 4,80 41,12 ± 3,14 ASAT (U/l) Lô chứng 42,70 ± 2,90 47,16 ± 14,09 41,39 ± 2,77 Lô thử 1 49.71 ±6.33 59,43 ± 11,84 57,67 ± 3,71 Lô thử 2 44,47 ± 2,18 52,93 ± 9,70 52,67 ± 5,32 Bilirubin (µmol/l) Lô chứng 0,82 ± 0,12 0,57 ± 0,04 0,86 ± 0,12 Lô thử 1 0,73 ± 0,05 0,71 ± 0,07 0,76 ± 0,08 Lô thử 2 0,89 ± 0,07 0,75 ± 0,03 0,86 ± 0,10 Protein toàn phần (g/dl) Lô chứng 58,29 ± 1,97 57,59 ± 2,86 59,38 ± 2,66 Lô thử 1 58,82 ± 2,01 60,29 ± 2,29 58,22 ± 2,41 Lô thử 2 61,85 ± 1,97 58,80 ± 1,69 58,24 ± 0,70
Ghi chú: p (chứng- thử) tại cùng thời điểm > 0,05; p (trước – sau) ở các lô đều > 0,05.
* Nhận xét :
- Cao chiết ban di thực (liều 80 mg/kg và 320 mg/kg cân nặng) không làm thay đổi các thông số sinh hóa đánh giá chức năng gan như : hoạt độ enzym ASAT, ALAT, nồng độ protein toàn phần, nồng độ bilirubin huyết tương của lô thỏ uống mẫu thử so với lô chứng tại cùng một thời điểm: trước khi dùng thuốc, sau khi uống thuốc 15 ngày và sau khi uống thuốc 30 ngày (p > 0,05).
- Trong cùng một lô, các thông số sinh hóa đánh giá chức năng gan như : hoạt độ enzym ASAT, ALAT, nồng độ protein toàn phần, nồng độ bilirubin huyết tương tại thời điểm sau khi uống thuốc 15 ngày và sau khi uống thuốc 30 ngày đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm trước khi dùng thuốc (p > 0,05).
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của cao chiết ban di thực đến các thông số sinh hóa đánh giá chức năng thận của thỏ thí nghiệm
Các thông số sinh hóa Trƣớc khi dùng thuốc Sau khi dùng thuốc 15 ngày Sau khi dùng thuốc 30 ngày Ure (mg/dl) Lô chứng 5,99 ± 0,70 3,04 ± 0,39 4,29 ± 0,59 Lô thử 1 6,09 ± 0,32 5,00 ± 0,68 4,43 ± 0,70 Lô thử 2 6,21 ± 0,41 5,56 ± 0,45 5,96 ± 1,09 Creatinin (µmol/l) Lô chứng 108,63 ± 4,24 86,82 ± 3,29 121,56 ± 6,95 Lô thử 1 104,27 ± 7,80 89,72 ± 3,81 106,12 ± 3,34 Lô thử 2 103,84 ± 3,72 91,57 ± 4,30 109,47 ± 4,25
Ghi chú: p (chứng- thử) tại cùng thời điểm > 0,05; p (trước – sau) ở các lô đều > 0,05.
* Nhận xét:
- Cao chiết ban di thực (liều 80 mg/kg và 320 mg/kg cân nặng) không làm thay đổi các thông số sinh hóa đánh giá chức năng gan như : hoạt độ enzym ASAT, ALAT, nồng độ protein toàn phần, nồng độ bilirubin huyết tương của lô thỏ uống mẫu thử so với lô chứng tại cùng một thời điểm: trước khi dùng thuốc, sau khi uống thuốc 15 ngày, sau khi uống thuốc 30 ngày (p > 0,05).
- Trong cùng một lô, các thông số sinh hóa đánh giá chức năng thận như: nồng độ creatinin, nồng độ ure huyết thanh tại thời điểm sau khi uống thuốc 15 ngày, sau khi uống thuốc 30 ngày đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm trước khi dùng thuốc (p > 0,05).
3.2.2.4. Xét nghiệm mô bệnh học
Hình thái vi thể gan
- Lô chứng: tế bào gan có kích thước đều, không có thoái hóa hoặc các ổ hoại tử, khoảng cửa không viêm, tĩnh mạch trung tâm và xoang mạch không xung huyết.
- Lô thử 1 và lô thử 2 (uống cao chiết ban di thực liều 80 mg cao/kg và 320 mg cao/kg) sau 30 ngày uống thuốc: các tế bào gan bình thường, có kích thước đều, tĩnh mạch trung tâm và xoang mạch không xung huyết, không có thoái hóa, hoại tử, khoảng cửa không viêm.
Hình 3.4. Cấu trúc vi thể gan của lô thử 1 sau 30 ngày uống mẫu thử (HE x 20)
Hình 3.5. Cấu trúc vi thể gan của lô thử 1 sau 30 ngày uống mẫu thử (HE x 20)
Ghi chú: HE x 20: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 20 lần
Hình thái vi thể thận
- Lô chứng: cầu thận kích thước đều, không xơ hóa, ống thận không tổn thương, mô kẽ không viêm, không xung huyết.
- Lô thử 1 và lô thử 2 (uống cao chiết ban di thực liều 80 mg cao/kg và 320 mg cao/kg) sau 30 ngày uống thuốc: thận kích thước đều, mô kẽ không viêm, ống thận không có tổn thương, không xung huyết.
Hình 3.6. Cấu trúc vi thể thận của lô thỏ chứng sau 30 ngày thí nghiệm (HE x 20)
Hình 3.7. Cấu trúc vi thể thận của lô thử 1 sau 30 ngày uống mẫu thử (HE x20)
Hình 3.8. Cấu trúc vi thể thận của lô thử 2 sau 30 ngày uống mẫu thử (HE x 20)
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Về tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập
4.1.1. Gây stress cho chuột bằng nuôi cô lập
Mô hình gây stress do nuôi cô lập mà chúng tôi triển khai trong nghiên cứu áp dụng theo phương pháp đang được tiến hành tại phòng thí nghiệm Dược lí, Đại học Toyama, Nhật Bản, do giáo sư Kinzo Matsumoto nghiên cứu. Mô hình này được xây dựng ở Nhật từ những năm 1995 để nghiên cứu dược lí thần kinh nói chung và sau đó đã được sử dụng để đánh giá tác dụng an thần của một số dược liệu [59], [60], [74]. Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Thu Hương bước đầu triển khai mô hình trong nghiên cứu của mình để chứng minh tác dụng chống stress và trầm cảm của nhân sâm Việt Nam. Nhóm nghiên cứu Bộ môn Dược lí trường Đại học Dược Hà Nội đã triển khai mô hình này để đánh giá tác dụng an thần của chế phẩm Sleepy care, đánh giá tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm của một số loài trong chi Stephania
Lour [2], [12].
Nuôi cô lập gây ra những thay đổi trong hành vi cũng như những thay đổi về sinh lí thần kinh của động vật thí nghiệm. Nhiều biểu hiện trong số những thay đổi này tương tự như các triệu chứng được tìm thấy trong các bệnh tâm thần như trầm cảm, rối loạn lo âu và rối loạn stress sau chấn thương [38], [57], [58]. Cơ chế sinh hóa thần kinh được giả thuyết liên quan đến việc giảm đáp ứng của receptor GABAA đối với thuốc thông qua ức chế sinh tổng hợp 3α, 5α- tetrahydroprogesteron và thay đổi biểu hiện của receptor GABAA (giảm tiểu đơn vị α1, α2, γ2; tăng tiểu đơn vị α4, α5) [57], [58]. Cũng theo nghiên cứu của Ojima và cộng sự, chuột chịu stress do cô lập thể hiện trạng thái lo âu rõ rệt hơn nhóm chuột nuôi bầy đàn. Sự thay đổi hành vi của chuột chịu stress liên quan đến hoạt hóa hệ noradrenergic trung ương và yếu tố giải phóng corticotrophin (CRF) ở vùng dưới đồi hay giảm khả năng điều biến của GABA trong việc mở kênh Cl-, có thể thay đổi tác dụng giải lo âu của các thuốc [66].
Nhóm nghiên cứu lựa chọn 2 mô hình là mô hình chữ thập nâng cao (EPM) và mô hình môi trường mở (OFT) để đánh giá tác dụng giải lo âu và lựa chọn mô hình tương tác cộng đồng để đánh giá tác dụng chống trầm cảm của cao chiết ban di thực trên chuột nhắt trắng đã gây stress cô lập.
Rối loạn lo âu và trầm cảm thường đi kèm với nhau, biểu hiện ở những bệnh nhân rối loạn hoảng sợ thường có triệu chứng trầm cảm kèm theo hoặc không kèm theo rối loạn trầm cảm và các bệnh nhân trầm cảm có thể gặp cơn hoảng loạn khi quá lo lắng [40]. Tìm hiểu về cơ chế sinh hóa thần kinh thì cả lo âu và trầm cảm đều thông qua các hệ thống dẫn truyền thần kinh và chất dẫn truyền thần kinh như noradrenergic, serotonergic, γ- aminobutyric acid (GABA) và serotonin (5- HT) [40]. Các thuốc điều trị rối loạn lo âu cũng thường có tác dụng chống trầm cảm và ngược lại: thuốc ức chế chọn lọc thu hồi serotonin đại diện là fluoxetin, paroxetin, setralin; thuốc chống trầm cảm ba vòng có đại diện là imipramin, clomipramin. Vì vậy, trên cơ sở đó, chúng tôi đánh giá tác dụng giải lo âu và tác dụng chống trầm cảm của cao chiết ban di thực trên mức liều giống nhau ở tất cả các mô hình trong nghiên cứu. Ngoài ra, thời gian sử dụng thuốc nghiên cứu cũng có ảnh hưởng đến tác dụng của thuốc. Các thuốc chống trầm cảm ở những liều đầu tiên làm gia tăng sự lo lắng và tác dụng giải lo âu chỉ có được khi sử dụng thuốc kéo dài [18], [45]. Nghiên cứu tác dụng của imipramin trên mô hình chữ T nâng cao, mô hình chữ thập nâng cao, mô hình môi trường mở, mê cung nước Morris, thử nghiệm treo đuôi chuột đều cho thấy tác dụng giải lo âu của thuốc chỉ được ghi nhận khi sử dụng kéo dài (14- 21 ngày) trên động vật thực nghiệm [44], [45], [65], [72], [77].
Để làm cơ sở cho việc đánh giá tác dụng của cao chiết từ dược liệu ban di thực, ngoài chứng dương imipramin, chúng tôi sử dụng thêm một thuốc tham chiếu là Laif 900 mg- viên nén chứa cao chiết từ ban Âu, sản phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường châu Âu. Ở đây, cả cao chiết ban Âu và cao chiết ban di thực đều được tiêu chuẩn hóa theo hàm lượng hypericin toàn phần.
Tác dụng của cao chiết ban di thực được thử nghiệm ở 2 mức liều: 240 mg/kg và 480 mg/kg. Kết quả cho thấy, tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm của cao chiết ban di thực phụ thuộc vào liều sử dụng. Cao chiết ban di thực ở liều 240 mg/kg (liều
tương đương với liều sử dụng trên người) có xu hướng thể hiện tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm trên tất cả các mô hình tuy nhiên, tác dụng chỉ thể hiện rõ rệt trên mô hình chữ thập nâng cao. Với mức liều cao gấp đôi (480 mg/kg), cao chiết đã thể hiện tác dụng khá rõ trên tất cả các mô hình sử dụng trong nghiên cứu.
4.1.2. Tác dụng giải lo âu của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập
Mô hình môi trường mở
Mô hình môi trường mở (OFT) là mô hình đánh giá hoạt động tự nhiên, khả năng khám phá và tình trạng lo lắng của chuột khi được đặt vào một môi trường mới khác biệt hoàn toàn môi trường sống bầy đàn [76]. Vùng trung tâm là vùng nằm chính giữa, có khoảng không gian xung quanh khác biệt với vùng viền ngoài giáp với các bức tường của mô hình [34]. Hoạt động vận động tự nhiên của chuột được đo lường qua số đường kẻ chuột đi qua và số lần đứng lên bằng hai chân. Số lần vào trung tâm và thời gian lưu lại trung tâm là những chỉ tiêu giúp đánh giá khả năng khám phá và tình trạng lo lắng của chuột [26], [69]. Ngoài các tiêu chí quan sát như hoạt động ngắm vuốt, số lượng phân và nước tiểu chuột [27], [51], [62]… cũng giúp đánh giá tình trạng lo lắng của chuột. Có thể kể đến một số dược liệu được đánh giá tác dụng trên mô hình này như: Foeniculum vulgare M. [52],
Spondias Mombin L. [19], Nardostachys jatamansi D.C. [71].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn tiêu chí đánh giá là thời gian lưu lại trung tâm của chuột, khi chỉ số này cho thấy sự gia tăng về khả năng khám phá và giảm tình trạng lo lắng của chuột khi tiếp xúc với môi trường mới. Kết quả cho thấy: Tác dụng của cao chiết ban di thực phụ thuộc vào liều, thể hiện ở mức liều 240 mg/kg có xu hướng làm tăng thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm nhưng chưa đạt mức có ý nghĩa thống kê, còn ở liều cao hơn là 480 mg/kg làm tăng khả năng khám phá của chuột, làm tăng có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm. Tác dụng này tương đương imipramin. Còn Laif 900 mg ở liều 1000 mg/kg cân nặng chuột lại không thể hiện tác dụng rõ rệt trên mô hình này.
Mô hình chữ thập nâng cao (EPM) là mô hình kinh điển sử dụng trong sàng lọc các thuốc có tác dụng giải lo âu với chỉ tiêu đánh giá là số lần chuột vào tay hở và thời gian chuột lưu lại ở cánh tay hở. Nguyên tắc của mô hình dựa trên tâm lí căng thẳng, sợ hãi với những khu vực hở và cao, thái độ thăm dò, khám phá của động vật thí nghiệm với môi trường mới và lạ. Mô hình được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu bởi mô hình thích hợp để đánh giá nhiều hợp chất tác dụng thông qua nhiều hệ receptor như GABA, serotonin, dopamin với độ lặp lại cao [24], [29], [33], [80]. Mô hình EPM đã được dùng để đánh giá tác dụng giải lo âu của một số dược liệu: Apocynum venetum L. [46], Panax ginseng C.A.Meyer (nhân sâm) [32],
Passiflora incarnata L. [36]...Chuột được sử dụng thuốc không còn lo âu, sợ hãi với những khu vực hở, cao; bản năng thăm dò, khám phá với môi trường lạ tăng lên, biểu hiện: tăng số lần lưu lại tay hở, tăng thời gian lưu lại tay hở. Kết quả cho thấy: cao chiết ban di thực ở các mức liều 240 mg/kg và 480 mg/kg làm tăng có ý nghĩa thời gian và số lần lưu lại tay hở; tác dụng này tương đương với imipramin. So sánh với chế phẩm Laif 900 mg ở liều 1000 mg/kg cân nặng chuột chỉ làm tăng có ý nghĩa số lần lưu lại tay hở của chuột.
Tác dụng giải lo âu trên mô hình EPM và OFT quan sát được trong nghiên cứu này cũng tương đồng với kết quả đã công bố trước đây của Kumar V. và cộng sự [54]. Theo đó, sử dụng liều 100 mg/kg và 200 mg/kg cao chiết cồn 50% ban Ấn Độ lặp lại 3 ngày qua đường uống cho chuột cống trắng làm tăng thời gian và số lần lưu lại tay hở, giảm thời gian và số lần lưu lại tay kín (mô hình EPM), tăng thời gian lưu lại trung tâm (mô hình OFT) của chuột thí nghiệm và tác dụng giải lo âu này cũng phụ thuộc vào liều. Tuy nhiên, điểm khác biệt trong nghiên cứu của Kumar V. là thời gian sử dụng thuốc nghiên cứu chỉ là 3 ngày.
4.1.3. Tác dụng chống trầm cảm của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập
Mô hình tương tác cộng đồng
Rối loạn hành vi tương tác cộng đồng và nhận thức cộng đồng là đặc trưng của nhiều chứng rối loạn tâm thần như trầm cảm, tự kỉ, rối loạn lưỡng cực, rối loạn ám ảnh cưỡng chế, tâm thần phân liệt [37], [50]. Để phát triển các liệu pháp điều trị
cho các bệnh tâm thần nêu trên, các nhà khoa học sử dụng các mô hình động vật và các thử nghiệm phù hợp. Thử nghiệm ba buồng được phát triển bởi tác giả Crawley (2004) và được sử dụng rộng rãi để đánh giá ái lực cộng đồng và trí nhớ cộng đồng trên chuột [63]. Nguyên lí của thử nghiệm này dựa trên sự lựa chọn của chuột- loài động vật có tính cộng đồng cao, chuột có xu hướng thích viếng thăm vào buồng có chuột đồng loại hay thích một mình. Theo đó, tính hòa đồng trong trường hợp này được định nghĩa là khuynh hướng viếng thăm chuột khác khi được so sánh với thời gian một mình tại một buồng có điều kiện tương tự [35]. Kết quả cho thấy: cả Laif liều 1000 mg/kg cân nặng chuột và cao chiết ban di thực với liều 240 mg/kg và 480 mg/kg đều cải thiện hành vi tương tác cộng đồng, biểu hiện thời gian bước vào buồng có chuột nhiều hơn thời gian bước vào buồng trống và sự khác biệt này đạt mức có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, số lần chuột vào buồng có chuột đồng loại lại không nhiều hơn có ý nghĩa thống kê số lần vào buồng trống. Như vậy, kết quả nghiên cứu trên một số mô hình thực nghiệm triển khai trong đề tài đã chứng minh được tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm của cao chiết ban di thực. Cùng với việc đánh giá tác dụng này, nghiên cứu cũng tiến hành so sánh tác dụng của cao chiết từ dược liệu ban di thực với dược liệu ban Âu, cho thấy cây ban Âu (Hypericum