Mô hình tương tác cộng đồng được tiến hành theo mô tả của Crawley [35].
* Phương pháp tiến hành:
Nhóm chuột nuôi bầy đàn và nhóm chuột gây stress do cô lập được chia ngẫu nhiên thành các lô và cho uống mẫu thử tương ứng liên tục trong 25 ngày, mỗi ngày 1 lần vào 8h sáng.
Nhóm nuôi bầy đàn - Lô 1: uống nước cất
- Lô 2: uống nước cất
- Lô 3: tiêm màng bụng imipramin liều 8 mg/kg - Lô 4: uống chế phẩm Laif liều 1000 mg/kg
- Lô 5: uống cao chiết ban di thực liều 240 mg cao/kg - Lô 6: uống cao chiết ban di thực liều 480 mg cao/kg
Ngày thứ 25, sau khi uống mẫu thử 1 giờ hoặc sau khi tiêm imipramin 30 phút, tiến hành thí nghiệm. Thí nghiệm được chia làm 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn làm quen: Chuột thí nghiệm được đặt vào khoang giữa và cho tự do đi lại giữa các khoang trong vòng 5 phút để làm quen với môi trường mới.
+ Giai đoạn đánh giá: Sau 5 phút làm quen, chuột được đưa vào khoang giữa. Một chuột khỏe mạnh, đồng giới được nhốt trong hộp lưới tại ngăn bên phải; hộp lưới bên trái để trống. Sau đó chuột được tự do đi lại trong cả 3 khoang và tiếp xúc với chuột khỏe mạnh được nhốt trong hộp lưới tại ngăn bên phải trong vòng 10 phút. Chuột được coi là ở trong một buồng khi cả 4 chân đều nằm trong buồng đó. Sau tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi.
Để hạn chế sai lệch về khoảng thời gian giữa các cá thể trong lô, mỗi lô được cho uống thuốc làm hai đợt, mỗi đợt cách nhau 25 phút.
* Chỉ tiêu đánh giá: số lần bước vào buồng có chuột và buồng không có chuột, thời gian bước vào buồng có chuột và buồng không có chuột.
2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá độc tính của cao chiết ban di thực
2.3.2.1. Độc tính cấp của cao chiết ban di thực
* Phương pháp tiến hành:
Động vật thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Cho chuột nhịn đói 16 giờ và uống nước tự do theo nhu cầu.
Sau khi dò liều trên một số động vật nhất định, chia chuột ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con. Cho chuột uống bằng cách dùng bơm tiêm có kim đầu tù để đưa thuốc một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột. Cho từng lô chuột nhắt uống chế phẩm
thử với liều tăng dần. Thể tích chế phẩm thử mỗi lần cho uống là 0,2 ml/10 g chuột. Chuột được cho ăn trở lại 2 giờ sau khi dùng chế phẩm thử, uống nước bình thường.
Theo dõi chuột liên tục trong vòng 4 giờ đầu, theo dõi chuột chết trong vòng 72 giờ và tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột trong 7 ngày sau khi dùng chế phẩm thử. Các động vật chết được mổ để quan sát đại thể cơ quan phủ tạng [6], [7], [8], [10], [14], [23].
* Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tình trạng chung của chuột: da, lông, mắt, màng nhầy, hô hấp, tuần hoàn, hoạt động tự nhiên, tư thế, hành vi. Chú ý: run, rối loạn, chảy nước dãi, tiêu chảy, lịm đi, tình trạng ngủ và hôn mê.
- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.
- Xác định tỷ lệ động vật chết ở các lô trong 72 giờ để tính liều LD50.
- Xác định LD0, LD100, LD50: Tìm liều tối đa mà không có chuột nào của lô thí nghiệm chết (LD0) và liều tối thiểu để 100% chuột của lô thí nghiệm chết (LD100). Thử thêm 3 liều trung gian giữa 2 liều nói trên để xác định LD50.
LD50 (nếu có) được tính theo công thức Behrens – Karber:
LD50 = LD100 -
n b a
.
Trong đó: n: số động vật trong lô a: hiệu 2 liều kế tiếp
b: trung bình cộng số động vật chết ở 2 liều kế tiếp
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn của cao chiết ban di thực thực (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Phương pháp tiến hành:
Thỏ thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành các lô như sau:
+ Lô chứng (n= 10): uống nước cất
+ Lô thử 1 (n= 10): uống cao chiết ban di thực pha trong nước cất với liều 80 mg/kg + Lô thử 2 (n= 11): uống cao chiết ban di thực pha trong nước cất với liều 320 mg/kg
Hàng ngày cho thỏ các lô thử thuốc uống mẫu thử và lô thỏ chứng uống nước cất một lần với thể tích 5 ml/kg cân nặng. Thời gian uống liên tục trong 30 ngày [14].
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình đánh giá độc tính bán trường diễn của cao chiết ban di thực
* Chỉ tiêu đánh giá:
- Biểu hiện của động vật thí nghiệm: tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch, phân, nước tiểu, hoạt động tự nhiên, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.
- Sự thay đổi khối lượng cơ thể. - Các thông số sinh hóa:
+ Hoạt độ enzym ASAT, ALAT định lượng theo phương pháp Reitman- Frankel sửa đổi bởi Sevela dùng các cơ chất là L- aspartat và L-alanin.
+ Protein toàn phần định lượng bằng phương pháp Biuret. + Creatinin huyết thanh định lượng bằng phương pháp Jaffe.
+ Ure huyết định lượng bằng phương pháp Rappoport dùng enzym urease.
- Các thông số huyết học: số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỉ lệ hematocrit, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu và tỉ lệ % tế bào lympho.
- Đại thể các cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận, lách. Cân ngay khối lượng tim, gan, thận, lách và tính tỉ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể.
- Mô bệnh học: -3 0
Nuôi thích nghi Uống thuốc hàng ngày. Theo dõi hàng ngày, cân hàng tuần
Lấy máu xét nghiệm 15 Cân, làm vi thể gan, thận 30 Ngày - 3 - 5 0
Sau khi cho thỏ uống mẫu thử 30 ngày, mỗi lô lấy ngẫu nhiên 3 thỏ mổ để quan sát đại thể các cơ quan và kiểm tra cấu trúc vi thể gan, thận. Trường hợp mẫu gây độc: Các thỏ còn lại ngừng uống thuốc và tiếp tục nuôi 15 ngày nữa. Sau 15 ngày ngừng thuốc, tất cả các thỏ được mổ để quan sát đại thể các cơ quan và kiểm tra cấu trúc vi thể gan và thận mỗi lô 3 con. Cắt và đọc tiêu bản gan, thận bằng phương pháp nhuộm hematoxylin và eosin (HE), thực hiện ở Bộ môn giải phẫu bệnh- Trường đại học Y Hà Nội.
2.4. Xử lý số liệu
Dữ liệu được lưu trữ và phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 và được biểu diễn dưới dạng X ± SE ( X: giá trị trung bình; SE: sai số chuẩn). Qua phân tích kiểm chuẩn Kolmogorow – Smirnow cho thấy một số dữ liệu không tuân theo phân bố chuẩn. Vì vậy, mẫu không tuân theo phân bố chuẩn và các mẫu mà biến có tính chất không liên tục được kiểm định bằng test phi tham số Kruskal – Wallis sau đó là Mann - Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập chuột chịu stress do nuôi cô lập
3.1.1. Tác dụng giải lo âu của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập cô lập
Mô hình không gian mở
Ảnh hưởng trên thời gian vào vùng trung tâm của imipramin, chế phẩm Laif và cao chiết ban di thực ở hai nhóm chuột nuôi bầy đàn và chuột chịu stress do cô lập được trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của mẫu thử lên thời gian vào vùng trung tâm của chuột đã gây stress cô lập
* Nhận xét:
- Trên chuột chịu stress do cô lập biểu hiện giảm khả năng khám phá, thể hiện ở sự giảm có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm bầy đàn (p < 0,01).
- Imipramin liều 8 mg/kg làm tăng khả năng khám phá của chuột rõ rệt, làm tăng có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm chứng chịu stress do nuôi cô lập (p < 0,01). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Laif liều 1000 mg/kg không ảnh hưởng tới khả năng khám phá của chuột, không làm thay đổi có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm chứng chịu stress do nuôi cô lập (p > 0,05).
- Tác dụng của cao chiết ban di thực phụ thuộc vào liều, thể hiện ở mức liều 480 mg/kg làm tăng khả năng khám phá của chuột, làm tăng có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm chứng chịu stress do nuôi cô lập (p < 0,05); liều 240 mg/kg không thể hiện tác dụng này. Tác dụng này tương đương imipramin.
Mô hình chữ thập nâng cao
Tác dụng của imipramin, chế phẩm Laif và cao chiết ban di thực ở hai nhóm chuột nuôi bầy đàn và chuột chịu stress do cô lập trên mô hình chữ thập nâng cao được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mẫu thử lên thời gian lưu lại tay hở và số lần di chuyển vào tay hở của chuột đã gây stress cô lập
Lô Chuột/mẫu thử n Thời gian lƣu lại tay hở (giây) Số lần vào tay hở Tổng số lần vào tay kín và tay hở 1 Bầy đàn- nước 10 93,7 ± 2,72 6,40 ± 0,45 18,70 ± 0,91 *p2-1 = 0,038 *p2-1 = 0,037 p2-1 = 0,237 2 Cô lập- nước 14 66,50 ± 11,57 3,93 ± 0,88 16,21 ± 1,59 3 Cô lập- Imipramin 8 mg/kg (tiêm) 9 105,44 ± 12,10 6,56 ± 0,77 16,44 ± 2,14 *p2-3 = 0,036 p2-3= 0,050 p2-3 = 0,931 4 Cô lập- Laif 1000 mg/kg 10 83,40 ± 12,35 6,10 ± 0,28 15,60 ± 0,76 p2-4 = 0,337 *p2-4 = 0,032 p2-4 = 0,732 5 Cô lập- cao ban
240 mg/kg
11 107,45 ± 10,74 9,36 ± 1,36 19,82 ± 2,16 *p2-5 = 0,019 **p2-5 = 0,002 p2-5 = 0,183
p3-5 = 0,902 p3-5 = 0,107 6 Cô lập- cao ban
480 mg/kg
12 102,08 ± 8,08 8,17 ± 0,73 19,50 ± 1,22 *p2-6 = 0,019 **p2-6 = 0,001 p2-6 = 0,124
p3-6 = 0,813 p3-6 = 0,149
Ghi chú: ** p < 0,01; * p < 0,05 so với nhóm chứng chịu stress
* Nhận xét:
- Trên chuột chịu stress do cô lập biểu hiện trạng thái lo âu rõ rệt, thể hiện ở sự giảm có ý nghĩa số lần di chuyển vào tay hở và thời gian lưu lại tay hở so với nhóm bầy đàn (p < 0,05).
- Imipramin liều 8 mg/kg thể hiện tác dụng giải lo âu rõ rệt, làm tăng có ý nghĩa thời gian và số lần lưu lại tay hở so với nhóm chứng chịu stress do cô lập (p < 0,05). - Laif liều 1000 mg/kg làm tăng có ý nghĩa số lần lưu lại tay hở so với nhóm chứng chịu stress (p < 0,05) và có xu hướng tăng thời gian lưu lại tay hở so với nhóm chứng chịu stress tuy nhiên sự khác biệt chưa đạt mức có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
- Cao chiết ban di thực ở các mức liều 240 mg/kg và 480 mg/kg thể hiện tác dụng giải lo âu rõ rệt, làm tăng có ý nghĩa thời gian và số lần lưu lại tay hở so với nhóm chứng chịu stress do cô lập (p < 0,05 và p <0,01 tương ứng). Tác dụng này tương đương với imipramin.
3.1.2. Tác dụng chống trầm cảm của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập
Mô hình tương tác cộng đồng
Tác dụng của imipramin, chế phẩm Laif và cao chiết ban di thực ở hai nhóm chuột nuôi bầy đàn và chuột chịu stress do cô lập trên mô hình tương tác cộng đồng được trình bày ở hình 3.2 và bảng 3.2.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của mẫu thử lên số lần vào buồng có chuột/ buồng không có chuột của chuột đã gây stress cô lập
(** p < 0,01; * p < 0,05 so với nhóm chứng chịu stress) * Nhận xét:
Ở tất cả các lô: chuột bầy đàn, chuột chịu stress do nuôi cô lập, chuột chịu stress do cô lập sau khi dùng imipramin liều 8 mg/kg hoặc chế phẩm Laif liều 1000 mg/kg hoặc cao chiết ban di thực liều 240 mg/kg, 480 mg/kg đều có số lần bước
vào buồng có chuột đồng loại và buồng không có chuột không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mẫu thử lên thời gian vào buồng có chuột/ buồng không có chuột của chuột đã gây stress cô lập
Lô Chuột/mẫu thử n Thời gian vào buồng có
chuột
Thời gian vào buồng không có chuột p 1 Bầy đàn- nước 12 328,75 ± 33,74 165,58 ± 24,84 **p1 = 0,001 2 Cô lập- nước 11 190,18 ± 28,06 248,45 ± 36, 43 p2 = 0,220 3 Cô lập- Imipramin 8 mg/kg (tiêm) 11 258,73 ± 17,86 158,73 ± 16,57 **p3 = 0,001 4 Cô lập- Laif 1000 mg/kg 10 297,70 ± 27,67 161,80 ± 33,29 **p4 = 0,006
5 Cô lập- cao ban 240 mg/kg
13 271,62 ± 20,04 172,23 ± 22,46 **p5 = 0,003 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6 Cô lập- cao ban 480 mg/kg
11 265,64 ± 14,50 189,18 ± 15,98 **p6 = 0,002
Ghi chú: ** p < 0,01; * p < 0,05 so với nhóm chứng chịu stress
* Nhận xét:
- Chuột nuôi bầy đàn có thời gian bước vào buồng có chuột đồng loại nhiều hơn so với thời gian bước vào buồng không có chuột, sự khác biệt này đạt mức có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).
- Đối lập với chuột bầy đàn, chuột chịu stress do nuôi cô lập có thời gian bước vào buồng có chuột đồng loại và buồng không có chuột không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Chuột cô lập có xu hướng sử dụng nhiều thời gian ở buồng không có chuột hơn buồng có chuột đồng loại.
- Chuột chịu stress do cô lập sau khi dùng imipramin liều 8 mg/kg hoặc chế phẩm Laif liều 1000 mg/kg có thời gian bước vào buồng có chuột nhiều hơn thời gian bước vào buồng không có chuột và sự khác biệt này đạt mức có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).
- Cao chiết ban di thực với liều 240 mg/kg và 480 mg/kg có tác dụng trên chuột chịu stress do cô lập, biểu hiện thời gian bước vào buồng có chuột nhiều hơn thời gian bước vào buồng trống và sự khác biệt này đạt mức có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).
3.2. Kết quả đánh giá độc tính cấp tính và độc tính bán trƣờng diễn của cao chiết ban di thực chiết ban di thực
3.2.1. Độc tính cấp của cao chiết ban di thực
Thí nghiệm được tiến hành nhằm thăm dò độc tính cấp và xác định liều LD50 của cao chiết ban di thực trên chuột nhắt trắng ở 6 mức liều như sau:
Lô 1: uống cao chiết ban di thực liều 9,29 g/kg chuột Lô 2: uống cao chiết ban di thực liều 13,94 g/kg chuột Lô 3: uống cao chiết ban di thực liều 18,58 g/kg chuột Lô 4: uống cao chiết ban di thực liều 23,23 g/kg chuột Lô 5: uống cao chiết ban di thực liều 31,43 g/kg chuột Lô 6: uống cao chiết ban di thực liều 39,29 g/kg chuột
Biểu hiện của chuột được theo dõi trong 72 giờ và sau khi chuột chết mổ chuột để quan sát đại thể. Ở lô 1, tất cả các chuột đều khỏe mạnh, hoạt động, ăn uống, bài tiết bình thường. Ở các lô 2, 3, 4 và 5, một số chuột bắt đầu cố biểu hiện run rẩy, co giật, sau đó 4 chân duỗi thẳng cứng đờ, có những chuột sẽ qua được cơn co giật, số chuột chết tập trung trong khoảng 24 giờ đầu. Ở liều càng cao, chuột chết càng nhanh. Những chuột còn sống sót vẫn hoạt động, bài tiết bình thường, ăn uống lúc đầu ít hơn, sau đó thì bình thường. Kết quả thử độc tính cấp được trình bày ở bảng