Điều kiện tiến hành thí nghiệm
Tất cả các thí nghiệm trên được tiến hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh. Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được đưa vào phòng thí nghiệm để làm quen với điều kiện thí nghiệm trước 1 giờ. Chuột được cho dùng thuốc vào 8 giờ sáng hàng ngày, tiến hành các thí nghiệm sau khi cho chuột dùng thuốc 1 giờ. Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 9h – 17h.
Liều thuốc thử và thuốc đối chiếu
- Mức liều của chứng dương imipramin được sử dụng trong nghiên cứu là 8 mg/kg, sử dụng dài ngày (14; 21 ngày) theo các nghiên cứu của Nilsson và cộng sự, Rozza và cộng sự, Gomes và cộng sự, Griebel và cộng sự [44], [45], [65], [72].
- Dược liệu ban di thực: Cao chiết ban Âu tiêu chuẩn hóa theo hàm lượng hypericin toàn phần là 0.3% được ghi trong dược điển Mĩ (USP). Liều điều trị của cao chiết ban Âu là từ 1000- 2000 mg cao chiết/ngày/người. Dựa trên cơ sở đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn liều trên động vật thí nghiệm ngoại suy từ liều trên người là 1000 mg và 2000 mg cao chiết/người/ngày. Cụ thể:
Liều trên chuột nhắt: sử dụng 2 mức liều của cao chiết ban di thực là 240 mg/kg và 480 mg/kg (quy đổi liều từ người sang chuột nhắt trắng là 12)
Liều trên thỏ: sử dụng 2 mức liều của cao chiết ban di thực là 80 mg/kg và 320 mg/kg (quy đổi liều từ người sang thỏ là 4)
- Liều của thuốc đối chiếu biệt dược Laif 900 mg (tỉ lệ thuốc : cao chiết là 3- 6/1), nhóm nghiên cứu sử dụng mức liều 1000 mg /kg cân nặng chuột (liều này tương đương với khoảng 240 mg cao chiết ban Âu/kg cân nặng chuột).
2.3.1. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm của cao chiết ban di thực
Hình 2.7. Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm đánh giá tác dụng dược lí trong nghiên cứu
2.3.1.1. Gây stress trên chuột bằng phương pháp nuôi cô lập
Mô hình gây stress bằng phương pháp cô lập được triển khai theo mô tả của Ojima và cộng sự [66]. Mô hình được triển khai như sau:
- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, giống đực, chủng Swiss albino, khối lượng trung bình 20 ± 2 g, 4 tuần tuổi nhận về được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 2 ngày. Sau đó chuột được chia ngẫu nhiên thành các lồng, 10- 15 con/lồng. Nuôi chuột bầy đàn trong vòng 5 tuần.
Bắt đầu 14 ngày Ngày thứ 15 Ngày thứ 20 Ngày thứ 25
Uống liều đầu tiên
Nuôi cô lập 5 tuần
15 ngày dùng thuốc 20 ngày dùng thuốc 25 ngày dùng thuốc
Mô hình OFT Mô hình EPM Mô hình tương tác
cộng đồng Cho dùng thuốc liên
- Sau đó, gây stress cô lập cho 1/ 2 số chuột bằng cách nuôi tách riêng mỗi con một lồng trong vòng 5 tuần. Chuột được cho ăn và uống nước đầy đủ theo nhu cầu. Lô bầy đàn được nuôi song song trong cùng thời gian với lô chuột được cô lập.
- Trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm, chuột được nuôi bằng thức ăn chuẩn, uống nước tự do. Tiến hành các thí nghiệm cho các lô nuôi bầy đàn và cô lập sau 5 tuần gây stress.
2.3.1.2. Mô hình không gian mở
Mô hình không gian mở được tiến hành theo mô tả của Todd và cộng sự [78].
* Phương pháp tiến hành:
Nhóm chuột nuôi bầy đàn và nhóm chuột gây stress do cô lập được chia ngẫu nhiên thành các lô và cho uống mẫu thử tương ứng liên tục trong 15 ngày, mỗi ngày 1 lần vào 8h sáng.
Nhóm nuôi bầy đàn - Lô 1: uống nước cất
Nhóm gây stress do cô lập - Lô 2: uống nước cất
- Lô 3: tiêm màng bụng imipramin liều 8 mg/kg - Lô 4: uống chế phẩm Laif liều 1000 mg/kg - Lô 5: uống cao chiết ban di thực liều 240 mg/kg - Lô 6: uống cao chiết ban di thực liều 480 mg/kg
Ngày thứ 15 sau khi uống mẫu thử 1 giờ hoặc sau khi tiêm imipramin 30 phút, chuột được đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm của mô hình không gian mở hướng về phía một cạnh của mô hình, sau đó chuột tự do di chuyển và khám phá trong thời gian 10 phút. Sau tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi.
Để hạn chế sai lệch về khoảng thời gian giữa các cá thể trong lô, mỗi lô được cho uống thuốc làm hai đợt, mỗi đợt cách nhau 25 phút.
* Chỉ tiêu đánh giá: thời gian chuột ở vùng trung tâm.
2.3.1.3. Mô hình chữ thập nâng cao
* Phương pháp tiến hành:
Nhóm chuột nuôi bầy đàn và nhóm chuột gây stress do cô lập được chia ngẫu nhiên thành các lô và cho uống mẫu thử tương ứng liên tục trong 20 ngày, mỗi ngày 1 lần vào 8h sáng.
Nhóm nuôi bầy đàn - Lô 1: uống nước cất
Nhóm gây stress do cô lập - Lô 2: uống nước cất
- Lô 3: tiêmmàng bụngimipramin liều 8 mg/kg - Lô 4: uống chế phẩm Laif liều 1000 mg/kg
- Lô 5: uống cao chiết ban di thực liều 240 mg cao/kg - Lô 6: uống cao chiết ban di thực liều 480 mg cao/kg
Ngày thứ 20 sau khi uống mẫu thử 1 giờ hoặc sau khi tiêm imipramin 30 phút, chuột được đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm, mặt hướng về phía cánh tay mở, sau đó chuột tự do di chuyển và khám phá trong thời gian 5 phút. Chuột được coi là ở trong một cánh tay khi cả 4 chân đều nằm trong cánh tay đó. Sau tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi.
Để hạn chế sai lệch về khoảng thời gian giữa các cá thể trong lô, mỗi lô được cho uống thuốc làm hai đợt, mỗi đợt cách nhau 25 phút.
* Chỉ tiêu đánh giá: số lần và thời gian lưu lại ở các cánh tay mở và kín của chuột.
2.3.1.4. Mô hình tương tác cộng đồng
Mô hình tương tác cộng đồng được tiến hành theo mô tả của Crawley [35].
* Phương pháp tiến hành:
Nhóm chuột nuôi bầy đàn và nhóm chuột gây stress do cô lập được chia ngẫu nhiên thành các lô và cho uống mẫu thử tương ứng liên tục trong 25 ngày, mỗi ngày 1 lần vào 8h sáng.
Nhóm nuôi bầy đàn - Lô 1: uống nước cất
- Lô 2: uống nước cất
- Lô 3: tiêm màng bụng imipramin liều 8 mg/kg - Lô 4: uống chế phẩm Laif liều 1000 mg/kg
- Lô 5: uống cao chiết ban di thực liều 240 mg cao/kg - Lô 6: uống cao chiết ban di thực liều 480 mg cao/kg
Ngày thứ 25, sau khi uống mẫu thử 1 giờ hoặc sau khi tiêm imipramin 30 phút, tiến hành thí nghiệm. Thí nghiệm được chia làm 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn làm quen: Chuột thí nghiệm được đặt vào khoang giữa và cho tự do đi lại giữa các khoang trong vòng 5 phút để làm quen với môi trường mới.
+ Giai đoạn đánh giá: Sau 5 phút làm quen, chuột được đưa vào khoang giữa. Một chuột khỏe mạnh, đồng giới được nhốt trong hộp lưới tại ngăn bên phải; hộp lưới bên trái để trống. Sau đó chuột được tự do đi lại trong cả 3 khoang và tiếp xúc với chuột khỏe mạnh được nhốt trong hộp lưới tại ngăn bên phải trong vòng 10 phút. Chuột được coi là ở trong một buồng khi cả 4 chân đều nằm trong buồng đó. Sau tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi.
Để hạn chế sai lệch về khoảng thời gian giữa các cá thể trong lô, mỗi lô được cho uống thuốc làm hai đợt, mỗi đợt cách nhau 25 phút.
* Chỉ tiêu đánh giá: số lần bước vào buồng có chuột và buồng không có chuột, thời gian bước vào buồng có chuột và buồng không có chuột.
2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá độc tính của cao chiết ban di thực
2.3.2.1. Độc tính cấp của cao chiết ban di thực
* Phương pháp tiến hành:
Động vật thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Cho chuột nhịn đói 16 giờ và uống nước tự do theo nhu cầu.
Sau khi dò liều trên một số động vật nhất định, chia chuột ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con. Cho chuột uống bằng cách dùng bơm tiêm có kim đầu tù để đưa thuốc một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột. Cho từng lô chuột nhắt uống chế phẩm
thử với liều tăng dần. Thể tích chế phẩm thử mỗi lần cho uống là 0,2 ml/10 g chuột. Chuột được cho ăn trở lại 2 giờ sau khi dùng chế phẩm thử, uống nước bình thường.
Theo dõi chuột liên tục trong vòng 4 giờ đầu, theo dõi chuột chết trong vòng 72 giờ và tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột trong 7 ngày sau khi dùng chế phẩm thử. Các động vật chết được mổ để quan sát đại thể cơ quan phủ tạng [6], [7], [8], [10], [14], [23].
* Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tình trạng chung của chuột: da, lông, mắt, màng nhầy, hô hấp, tuần hoàn, hoạt động tự nhiên, tư thế, hành vi. Chú ý: run, rối loạn, chảy nước dãi, tiêu chảy, lịm đi, tình trạng ngủ và hôn mê.
- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.
- Xác định tỷ lệ động vật chết ở các lô trong 72 giờ để tính liều LD50.
- Xác định LD0, LD100, LD50: Tìm liều tối đa mà không có chuột nào của lô thí nghiệm chết (LD0) và liều tối thiểu để 100% chuột của lô thí nghiệm chết (LD100). Thử thêm 3 liều trung gian giữa 2 liều nói trên để xác định LD50.
LD50 (nếu có) được tính theo công thức Behrens – Karber:
LD50 = LD100 -
n b a
.
Trong đó: n: số động vật trong lô a: hiệu 2 liều kế tiếp
b: trung bình cộng số động vật chết ở 2 liều kế tiếp
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn của cao chiết ban di thực thực
* Phương pháp tiến hành:
Thỏ thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành các lô như sau:
+ Lô chứng (n= 10): uống nước cất
+ Lô thử 1 (n= 10): uống cao chiết ban di thực pha trong nước cất với liều 80 mg/kg + Lô thử 2 (n= 11): uống cao chiết ban di thực pha trong nước cất với liều 320 mg/kg
Hàng ngày cho thỏ các lô thử thuốc uống mẫu thử và lô thỏ chứng uống nước cất một lần với thể tích 5 ml/kg cân nặng. Thời gian uống liên tục trong 30 ngày [14].
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình đánh giá độc tính bán trường diễn của cao chiết ban di thực
* Chỉ tiêu đánh giá:
- Biểu hiện của động vật thí nghiệm: tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch, phân, nước tiểu, hoạt động tự nhiên, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.
- Sự thay đổi khối lượng cơ thể. - Các thông số sinh hóa:
+ Hoạt độ enzym ASAT, ALAT định lượng theo phương pháp Reitman- Frankel sửa đổi bởi Sevela dùng các cơ chất là L- aspartat và L-alanin.
+ Protein toàn phần định lượng bằng phương pháp Biuret. + Creatinin huyết thanh định lượng bằng phương pháp Jaffe.
+ Ure huyết định lượng bằng phương pháp Rappoport dùng enzym urease.
- Các thông số huyết học: số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỉ lệ hematocrit, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu và tỉ lệ % tế bào lympho.
- Đại thể các cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận, lách. Cân ngay khối lượng tim, gan, thận, lách và tính tỉ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể.
- Mô bệnh học: -3 0
Nuôi thích nghi Uống thuốc hàng ngày. Theo dõi hàng ngày, cân hàng tuần
Lấy máu xét nghiệm 15 Cân, làm vi thể gan, thận 30 Ngày - 3 - 5 0
Sau khi cho thỏ uống mẫu thử 30 ngày, mỗi lô lấy ngẫu nhiên 3 thỏ mổ để quan sát đại thể các cơ quan và kiểm tra cấu trúc vi thể gan, thận. Trường hợp mẫu gây độc: Các thỏ còn lại ngừng uống thuốc và tiếp tục nuôi 15 ngày nữa. Sau 15 ngày ngừng thuốc, tất cả các thỏ được mổ để quan sát đại thể các cơ quan và kiểm tra cấu trúc vi thể gan và thận mỗi lô 3 con. Cắt và đọc tiêu bản gan, thận bằng phương pháp nhuộm hematoxylin và eosin (HE), thực hiện ở Bộ môn giải phẫu bệnh- Trường đại học Y Hà Nội.
2.4. Xử lý số liệu
Dữ liệu được lưu trữ và phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 và được biểu diễn dưới dạng X ± SE ( X: giá trị trung bình; SE: sai số chuẩn). Qua phân tích kiểm chuẩn Kolmogorow – Smirnow cho thấy một số dữ liệu không tuân theo phân bố chuẩn. Vì vậy, mẫu không tuân theo phân bố chuẩn và các mẫu mà biến có tính chất không liên tục được kiểm định bằng test phi tham số Kruskal – Wallis sau đó là Mann - Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập chuột chịu stress do nuôi cô lập
3.1.1. Tác dụng giải lo âu của cao chiết ban di thực trên chuột chịu stress do nuôi cô lập cô lập
Mô hình không gian mở
Ảnh hưởng trên thời gian vào vùng trung tâm của imipramin, chế phẩm Laif và cao chiết ban di thực ở hai nhóm chuột nuôi bầy đàn và chuột chịu stress do cô lập được trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của mẫu thử lên thời gian vào vùng trung tâm của chuột đã gây stress cô lập
* Nhận xét:
- Trên chuột chịu stress do cô lập biểu hiện giảm khả năng khám phá, thể hiện ở sự giảm có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm bầy đàn (p < 0,01).
- Imipramin liều 8 mg/kg làm tăng khả năng khám phá của chuột rõ rệt, làm tăng có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm chứng chịu stress do nuôi cô lập (p < 0,01).
- Laif liều 1000 mg/kg không ảnh hưởng tới khả năng khám phá của chuột, không làm thay đổi có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm chứng chịu stress do nuôi cô lập (p > 0,05).
- Tác dụng của cao chiết ban di thực phụ thuộc vào liều, thể hiện ở mức liều 480 mg/kg làm tăng khả năng khám phá của chuột, làm tăng có ý nghĩa thời gian chuột lưu lại vùng trung tâm so với nhóm chứng chịu stress do nuôi cô lập (p < 0,05); liều 240 mg/kg không thể hiện tác dụng này. Tác dụng này tương đương imipramin.
Mô hình chữ thập nâng cao
Tác dụng của imipramin, chế phẩm Laif và cao chiết ban di thực ở hai nhóm chuột nuôi bầy đàn và chuột chịu stress do cô lập trên mô hình chữ thập nâng cao được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mẫu thử lên thời gian lưu lại tay hở và số lần di chuyển vào tay hở của chuột đã gây stress cô lập
Lô Chuột/mẫu thử n Thời gian lƣu lại tay hở (giây) Số lần vào tay hở Tổng số lần vào tay kín và tay hở 1 Bầy đàn- nước 10 93,7 ± 2,72 6,40 ± 0,45 18,70 ± 0,91 *p2-1 = 0,038 *p2-1 = 0,037 p2-1 = 0,237 2 Cô lập- nước 14 66,50 ± 11,57 3,93 ± 0,88 16,21 ± 1,59 3 Cô lập- Imipramin 8 mg/kg (tiêm) 9 105,44 ± 12,10 6,56 ± 0,77 16,44 ± 2,14 *p2-3 = 0,036 p2-3= 0,050 p2-3 = 0,931