CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.4.3.Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp
1.4. Tổng quan về các phƣơng pháp nghiên cứu trong tổng hợp hữu cơ
1.4.3.Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp
Dùng máy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu đƣợc chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất.
1.4.4. Sắc kí cột
Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra. Nhƣng trong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định đƣợc nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là sắc kí cột. Với cột hấp phụ ngƣời ta có thể triển khai một dung môi liên tục, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột có thể là những ống hình trụ dài 30 – 100cm, đƣờng kính từ 1 – 8cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đƣờng kính.
1.4.5. Phương pháp nhồi cột huyền phù
Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phƣơng pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn.
Đổ lƣợng Al2O3 qua phễu, theo một ống đổ vào đáy cột. Rót từ từ đều đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phẳng không có chỗ rỗng, chỗ dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột ngƣời ta có thể dùng một đũa thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi nhận đƣợc một chiều cao nhất định.
1.4.6. Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí
1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ
Thông thƣờng ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
1.4.6.2. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bƣớc cơ bản sau:
Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp.
Chuẩn bị 4÷6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình dƣới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm đƣợc hệ dung môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví dụ n–hexan/EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí.
Với mẫu chất đƣợc chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ý:
Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau. Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn đƣợc ở trên nhƣng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ nhƣ silicagel tráng trên bản mỏng có kích thƣớc nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
Đối với sắc kí cột Sephadex ta thƣờng dùng một dung môi là MeOH.
29
1.4.6.3. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lƣợng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 – 50 lần khối lƣợng của mẫu chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 – 200 lần).
1.4.6.4. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột sắc kí
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đƣờng kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10:1.
Muốn biết lƣợng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho silicagel dạng khô (chƣa có dung môi) vào cột để quan sát.
1.4.6.5. Cách nạp silicagel vào cột
Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silicagel đƣợc nạp vào cột theo hai cách.
1.4.6.5.1. Nạp silicagel ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng. Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa). Cân lƣợng silicagel cần thiết (đã tính toán xác định đƣợc ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ý:
Không nên thực hiện ngƣợc lại nghĩa là rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
Lƣợng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc quá sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không đƣợc quá lỏng.
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại đầu cột).
Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột đƣợc đồng nhất.
Lưu ý:
Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt thoáng chƣa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tƣơng tự nhƣng cần ngâm sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trƣơng nở trƣớc khi cho vào cột.
1.4.6.5.2. Nạp silicagel dạng khô
Cột đƣợc giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào khoảng hai phần ba cột.
Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc rót trở lại đầu cột).
31
Thông thƣờng ngƣời ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
1.4.6.5.3. Cách nạp mẫu vào cột
Có hai phƣơng pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phƣơng pháp khô và phƣơng pháp ƣớt.
* Phương pháp nạp cột khô:
Mẫu đƣợc nạp ở dạng khô. Thƣờng áp dụng cho trƣờng hợp mẫu chất không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị mẫu: Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho một lƣợng silicagel vừa đủ (lƣợng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhƣng phải đủ để có thể cô quay mẫu đƣợc khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel đƣợc điều chỉnh lƣợng dung môi vừa đủ (đủ thấm ƣớt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã đƣợc gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
* Phương pháp cột ướt:
Thƣờng áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban đầu. Lƣợng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột.
Có thể áp dụng tính toán cụ thể nhƣ sau: thể tích dung môi cần lấy để hoà tan mẫu = 0,4.d2ml, với d là đƣờng kính trong của cột tính bằng mm.
Mẫu đƣợc cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phƣơng pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột. Sau đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lƣợng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong
cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống đƣợc đồng đều).
1.5. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ
Cấu trúc của chất phân lập ra đƣợc xác định bằng sự kết hợp của nhiều phƣơng pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà ngƣời ta sử dụng các phƣơng pháp khác nhau. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phƣơng pháp càng cao.
1.5.1.Điểm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan trọng. Thông thƣờng việc phân tích đầu tiên sau khi thu đƣợc một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lƣợng rất ít mẫu thử.
Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu đƣợc qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh khiết. Khi điểm chảy xác định đƣợc, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể đƣa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.5.2. Độ quay cực ([α]D)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trƣờng bất đẳng hƣớng, trong điều kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trƣờng làm cho cƣờng độ điện trƣờng chỉ còn dao động theo một phƣơng nhất định đƣợc gọi là ánh sáng phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phẳng chứa tia sáng và phƣơng dao động của vectơ điện trƣờng đƣợc gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc với mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc α. Tuỳ theo chất quang hoạt
33
α phụ thuộc vào nồng độ C (g/100ml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung môi) l, nhiệt độ t và chiều dài sóng λ:
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonancespectroscopy, NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay đƣợc dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hƣởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1
H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Các tần số cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học. Ngoài ra, đặc trƣng của phân tử còn đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau.
Phổ 1
H – NMR: Trong phổ 1H – NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton đƣợc xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng nhƣ đặc t rƣng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào những đặc trƣng của độ dịch chuyển hoá học cũng nhƣ tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hoá học của hợp chất.
Phổ 13
C – NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho một tín
hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13
C – NMR cũng đƣợc tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm).
Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khac nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 thì nằm về phía đối diện trên phổ DEPT 1350. Còn trên phổ DEPT 900
thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
Phổ 2D – NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tƣơng tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.
Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn các tƣơng tác xa của C và H trong phân tử. Nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định về cấu trúc.
Phổ HSQC: Đây là phổ biểu diễn các tƣơng tác của C và H liên kết trực tiếp với nhau trong phân tử. Nhƣ ở phổ HMBC, nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định về cấu trúc.
1.5.4. Phổ khối lượng (Mass spectrocopy, MS)
Phổ khối lƣợng đƣợc dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phƣơng pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hoá học các hợp chất.
Phổ EI – MS: Dựa vào sự phân mảnh ion dƣới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lƣợng khác nhau, phổ biến là 70 eV.
35
Phổ ESI – MS: Còn đƣợc gọi là phổ khối lƣợng phun mù điện tử. Phổ này đƣợc thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI – MS, do đó phổ thu đƣợc chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trƣng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lƣợng thấp, dễ phá vỡ.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Phản ứng ngƣng tụ giữa phthalide và 2- carboxybenzaldehydes để có đƣợc ben [d] indeno [1,2-b] -5,11-diones. Sau đó, các hợp chất này phản ứng với một amin bậc 1 để tạo ra các indenoisoquinolin khác nhau có nhóm thế chứa gốc R (sơ đồ 15). CHO COOH O O + NaOMe (266 mmol) MeOH/EtOAc 6h, 650C COOH O O O O O TsOH toluen N O O RNH2 R 71 72 73 74 134a : R = 134b : R = 134 134c : R = CH2- CH2Cl2 250C N CH2 - O N OCH3
Sơ đồ 15. Quy trình tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin có dị vòng thơm ở mạch nhánh.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu:
Phân tích các nguồn tài liệu có liên quan đến đề tài nghiên cứu (cơ sở lý thuyết liên quan đến đề tài, kết quả nghiên cứu đã công bố qua các tạp chí và báo cáo khoa học chuyên ngành trong và ngoài nƣớc, thƣ viện, các phƣơng tiện thông tin đại chúng… ).
37 Xử lý số liệu trên máy tính.
Các phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm trong tổng hợp hữu cơ. Phương pháp sắc kí bản mỏng: Sắc kí bản mỏng đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thƣờng sản phẩm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang khác nhau... Dùng sắc kí lớp mỏng để biết đƣợc phản ứng xảy ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng.
Phương pháp chiết: chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng (thƣờng là nƣớc) một pha lỏng khác không hòa tan vào nó (thƣờng là dung môi hữu cơ không hòa tan với nƣớc).
Phương pháp loại bỏ dung môi ở áp suất thấp: Dùng máy cất