3. Nhiệm vụ nghiên cứu
1.4.6.Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí
1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ
Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
1.4.6.2. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:
Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp. Chuẩn bị 4÷6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví dụ n–hexan/EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí.
Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
30
Chú ý:
Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.
Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn được ở trên nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ như silicagel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng một dung môi là MeOH.
1.4.6.3. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 – 50 lần khối lượng của mẫu chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 – 200 lần).
1.4.6.4. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột sắc kí
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10:1.
Muốn biết lượng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát.
1.4.6.5. Cách nạp silicagel vào cột
Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột theo hai cách.
a, Nạp silicagel ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng. Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa). Cân lượng silicagel cần thiết (đã tính toán xác định được ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ý:
Không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
31
Lượng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng để rót trở lại đầu cột).
Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột được đồng nhất.
Lưu ý:
Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt thoáng chưa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho vào cột.
b, Nạp silicagel dạng khô
Cột được giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào khoảng hai phần ba cột.
Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót trở lại đầu cột).
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào.
Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
32
Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khô và phương pháp ướt.
* Phương pháp nạp cột khô:
Mẫu được nạp ở dạng khô. Thường áp dụng cho trường hợp mẫu chất không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị mẫu: Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho một lượng silicagel vừa đủ (lượng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ để có thể cô quay mẫu được khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
* Phương pháp cột ướt:
Thường áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban đầu. Lượng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột.
Có thể áp dụng tính toán cụ thể như sau: thể tích dung môi cần lấy để hoà tan mẫu = 0,4.d2ml, với d là đường kính trong của cột tính bằng mm.
Mẫu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột. Sau đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều).