3. Nhiệm vụ nghiên cứu
1.3.5. Các dẫn xuất indenoisoquinolin có nhóm thế ethanol amino
59 N O NH OH O N O NH OH O H O2N N O NH OH O OCH3 H N O NH O O2N 62 61 60 OCH3
24
Tất cả các hợp chất trên đều có chứa nhóm thế ethanol amino mà hoạt tính sinh học lại thể hiện kém hơn so với các hợp chất vừa đề cập ở trên. Khi đính nhóm thế nitro ở vị trí số 3 ( Hợp chất 61) có rất ít ảnh hưởng đến khả năng gây độc tế bào (MGM 0,296µM) trong khi thay thế vị trí số 9 bằng nhóm thế methoxy (Hợp chất 62) làm gia tăng đáng kể trong hoạt tính gây độc nhưng khả năng ức chế Top I rất ít. Thêm vào đó là hợp 6-(3-(ethylamino)propyl)-9-methoxy-3-nitro-6H-indeno[1,2-c]isoquinoline- 5,11-dione (60) là đính cả nhóm nitro ở vị trí số 3 và nhóm methoxy vào vị trí số 9 là tăng đáng kể khả năng gây độc tế bào lên gấp 21 lần so với hợp chất gốc (59) với giá trị MGM 0,016µM và là chất ức chế Top I khá mạnh.
Một số nồng độ ức chế tăng trưởng GI50 của một số loại tế bào ung thư đã được kiểm nghiệm và chứng minh đối các dẫn xuất có nhóm thế ethanol amino (bảng 5) [9].
Bảng 5: Hoạt tính gây độc (GI50 µM) của các dẫn chất từ 59 – 62. Dòng tế bào Hợp chất thử Phổi Ruột Hệ thần kinh trung ương Khối u ác tính Buồng trứng Thận Tuyến tiền liệt Vú MGM (µM) Top1 cleav age 59 0,195 0 0,55 0,178 0,55 0,269 0,174 0,49 0,339 ++++ 60 <0,01 0 <0,01 <0,010 <0,010 0,012 <0,010 <0,010 0,016 ++++ 61 0,031 0,027 >100 0,2 1,35 0,229 >100 1,07 0,296 ++++ 62 0,026 0,044 0,112 0,55 0,417 0,158 0,055 0,389 0,124 0
25 1.3.6. Các dẫn chất có nhóm thế NO2 ở vòng A và các nhóm thế halogen như Cl, F và R1 là các nhóm amin vòng, amin bậc 1 và bậc 2 N O O R O2N R 1 N O O F O2N N N 64 N O O Cl O2N N N O O OMe O2N N N N 65 63 Hình 17: Các dẫn chất có nhóm thế NO2 ở vòng A và các nhóm thế halogen như Cl, F và R1 là các nhóm amin vòng, amin bậc 1 và bậc 2
Trong các dẫn xuất trên, hợp chất 63a (R=F, R1= N-metyl-piperazin) có hoạt tính và gây độc tế bào trên hai dòng Hep-G2 và HCT-116 với giá trị IC50 lần lượt là 0,019 và 0,093 µM. Ngoài ra, các chất 64 và 65a có hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư và hoạt tính ức chế top I tương đương và thậm chí cao hơn so với các thuốc Pototecan (2), Irinotecan (3) (hình 17)
Một số nồng độ ức chế tăng trưởng GI50 của một số loại tế bào ung thư đã được kiểm nghiệm và chứng minh đối các dẫn xuất có nhóm thế NO2 ở vòng A và các nhóm thế halogen như Cl, F và R1 là các nhóm amin vòng, amin bậc 1 và bậc 2 (Bảng 6) [9].
Bảng 6: Hoạt tính chống ung thư tế bào của các dẫn chất 63a-65i
Hợp chất R R1 A549 HepG2 (µM) HCT – 116(µM) Top cleavageb 1 0,064 2,24 66,3 ++++ 2 0,19 2,21 88,1 ++++ 63a F N N 0,021 0,019 0,0932 +++++ 63b F NCH2CH2OH 0,068 0,54 0,162 ++
26 63c F - NHCH2CH2OH 0,031 0,49 0,207 +++ 63d F - N(CH2CH3)2 3,52 2,77 0,741 ++ 63e F N N 0,035 0,91 0,159 +++ 63f F - N(CH(CH3)2)2 18,5 14,8 2,68 ++ 63g Cl N O 3,03 >100 >100 +++ 63h Cl N N 4,03 7,18 1,18 +++ 63i Cl - N(CH2CH3)2 3,28 9,42 1,79 ++++ 63j Cl - NHCH2CH2CH3 1,18 1,38 1,13 ++ 64 Cl N N 0,00482 2,21 1,23 +++++ 65a OCH3 N N 0,014 0,024 0,043 ++++ 65b OCH3 N 0,61 6,83 12,3 0/+ 65c OCH3 - NHCH2CH2CH3 0,00427 0,29 0,27 ++ 65d OCH3 N O 0,023 0,16 0,168 ++++ 65e OCH3 N N 0,0042 0,27 0,84 +++ 65f F Cl 22,4 >100 >100 +++ 65g Cl Cl 0,749 25,2 54 +++ 65i F N O >100 >100 >100 +++
27
1.4. Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu trong tổng hợp hữu cơ
1.4.1. Phương pháp sắc kí bản mỏng
Sắc kí bản mỏng được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thường sản phẩm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang khác nhau... Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng.
Phương pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel 60F254, aluminum oxide được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Dùng mao quản chấm một vết nhỏ dung dịch nguyên liệu đầu, một vệt là sản phản phản ứng khoảng 1cm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một hệ dung môi thích hợp n-hexan/EtOAc được đặt trong bình triển khai. Dung môi được chuyển lên bản sắc kí gặp phải mẫu thử và dung dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các chất với Rf khác nhau dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi. Hợp chất có tính phân cực sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí. Đối với những chất có UV ta kiểm tra UV có thể nhận được các vết khác nhau. Dựa vào các vết trên bản mỏng cùng với giá thị Rf tương ứng ta có thể nhận biết được phản ứng đã xảy ra hay chưa, nguyên liệu đầu còn hay hết.
Dựa vào tính chất đó chúng ta có thể tìm được dung môi hoặc hỗn hợp dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (Rf khác nhau) tìm được hệ dung môi cần để tinh chế các chất.
Có thể sử dụng một hỗn hợp hai dung môi. Trong hai dung môi đó một dung môi có khả năng hòa tan tốt chất kết tinh còn dung môi kia thì ngược lại hoặc ít tan. Hỗn hợp hai dung môi này phải hòa tan vào nhau tạo thành một dung dịch đồng nhất trong suốt.
Thông thường một chất dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hóa học gần gũi. Ví dụ các este dễ hòa tan trong cồn hoặc trong etylaxetat. Các hidrocacbon dễ tan
28
trong benzen, ete, dầu, n-hexan. Thường dung môi có nhiệt độ sôi từ 600C - 800C là thích hợp.
1.4.2. Chiết
Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước). Như vậy ta có quá trình chiết lỏng.
Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lượng nhỏ các tạp chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác. Ưu điểm của quá trình là thực hiện nhanh. Các thiết bị chiết đơn giản chỉ là phễu chiết thường người ta không cần thiết bị gì thêm.Chọn được dung môi (dung môi chiết CH2Cl2) và điều kiện chiết thích hợp với chất thử người ta có thể tách được bất kì cấu tử nào ra khỏi hỗn hợp bất kì. Trường hợp chất chiết có màu ta có thể sử dụng phần chiết vào mục đích phân tích định lượng theo các phương pháp đo quang.
1.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp
Dùng máy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu được chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất.
1.4.4. Sắc kí cột
Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra. Nhưng trong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là sắc kí cột. Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột có thể là những ống hình trụ dài 30 – 100cm, đường kính từ 1 – 8cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính.
29
1.4.5. Phương pháp nhồi cột huyền phù
Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn.
Đổ lượng Al2O3 qua phễu, theo một ống đổ vào đáy cột. Rót từ từ đều đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phẳng không có chỗ rỗng, chỗ dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi nhận được một chiều cao nhất định.
1.4.6. Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí
1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ
Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
1.4.6.2. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:
Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp. Chuẩn bị 4÷6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví dụ n–hexan/EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí.
Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
30
Chú ý:
Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.
Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn được ở trên nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ như silicagel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng một dung môi là MeOH.
1.4.6.3. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 – 50 lần khối lượng của mẫu chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 – 200 lần).
1.4.6.4. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột sắc kí
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10:1.
Muốn biết lượng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát.
1.4.6.5. Cách nạp silicagel vào cột
Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột theo hai cách.
a, Nạp silicagel ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng. Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa). Cân lượng silicagel cần thiết (đã tính toán xác định được ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ý:
Không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
31
Lượng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng để rót trở lại đầu cột).
Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột được đồng nhất.
Lưu ý:
Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt thoáng chưa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho vào cột.
b, Nạp silicagel dạng khô
Cột được giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào khoảng hai phần ba cột.
Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót trở lại đầu cột).
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào.
Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
32
Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khô và phương pháp ướt.
* Phương pháp nạp cột khô:
Mẫu được nạp ở dạng khô. Thường áp dụng cho trường hợp mẫu chất không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị mẫu: Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho một lượng silicagel vừa đủ (lượng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ để có thể cô quay mẫu được khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
* Phương pháp cột ướt:
Thường áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban đầu. Lượng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột.
Có thể áp dụng tính toán cụ thể như sau: thể tích dung môi cần lấy để hoà tan mẫu = 0,4.d2ml, với d là đường kính trong của cột tính bằng mm.
Mẫu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột. Sau đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều).
1.5. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ
Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà người ta sử