2. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
3.2.1. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn
Để xác định các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề, chúng tôi đã sử dụng các thuốc thử đặc trƣng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên và thu đƣợc kết quả trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả thử định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề (Plantago major L.)
Nhóm chất Phản ứng đặc trƣng Phân đoạn EtOH n – hecxan CHCl3 Alkanoid Dragendroff +++ +++ - Bouchardat +++ ++ ++ Mayen ++ + - Flavonoid Shinoda +++ ++ + Diazo ++ + + H2SO4 đặc +++ ++ + NaOH 10% +++ ++ +
Glycoside Keller – killian +++ +++ ++
Polyphenol khác NaOH 10% +++ ++ + FeCl3 5% ++ + + Tanin Vanilin ++ + - Gelatin ++ + - Acetat chì +++ - + Chú thích: (-) : Không phản ứng (++) : Phản ứng mạnh (+) : Phản ứng (+++) : Phản ứng rất mạnh
Từ bảng 3.2 cho thấy: Cao phân đoạn ethanol phản ứng dƣơng tính với tất cả các thuốc thử, cao n – hecxan cũng phản ứng mạnh với hầu hết thuốc thử (trừ axetat chì) chứng tỏ thành phần chất tự nhiên trong cao ethanol, cao n – hexan rất đa dạng. Cao phân đoạn chloroform có mức độ phản ứng không mạnh bằng hai cao PĐ trên (không phản ứng với dragendroff, mayen, vanilin, gelatin). Từ đó có thể thấy rằng thành phần các hợp chất tự nhiên trong loài Mã Đề khá
phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến nhƣ: flavonoid, tannin, alkaloid và glycoside. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hƣớng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Kết quả định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid galilic
Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bƣớc sóng 765nm. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic TT Acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hình 3.2. Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic
y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) O D 7 6 5 n m
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol
Bảng 3.4. Định lƣợng polyphenol các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề (Plantago major L.)
Mẫu OD765nm Hàm lƣợng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ polyphenol (%) Cao EtOH 0.558 556.7 5.567 Cao n – hexan 0.215 202.2 2.022 Cao CHCl3 0.11 97.2 0.972
Kết quả bảng 3.4 cho thấy hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các cao phân đoạn là khá cao. Cao EtOH là cao nhất (5.567%) sau đó đến cao phân đoạn n – hexan (2.022%) và thấp nhất là cao phân đoạn CHCl3 (0.972%).
Kết quả đó chỉ ra rằng, trong loài Mã Đề có chứa nhiều hợp chất tự nhiên có khả năng tan tốt trong cao EtOH, cao n – hexan và cao CHCl3. Điều này hoàn toàn phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực. Polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học, theo nhiều nghiên cứu thì polyphenol có vai trò rất quan trọng trong điều trị bệnh BP và ĐTĐ, nên chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn EtOH, n – hexan, CHCl3 điều trị cho chuột BP và ĐTĐ.
3.3. Kết quả tạo mô hình chuột BP và chuột ĐTĐ type 2
3.3.1. Kết quả xác định liều độc cấp LD50
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ loài Mã Đề trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp của Lorke [15]. Chuột cho nhịn đói trƣớc 16 giờ thí nghiệm, đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và đƣợc cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết loài Mã Đề.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Liều cao nhất 8000 mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chƣa thể tính đƣợc LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đƣờng uống.
3.3.2. Kết quả tạo mô hình chuột BP
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lƣợng ban đầu là 17 – 20g) đƣợc chia làm 8 lô.
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng).
Lô 2 – 8: Cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao.
Sau 6 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân khối lƣợng chuột. Kết quả sự thay đổi khối lƣợng của chuột thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Khối lƣợng trung bình (gam) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau
Nhóm
Tuần Nhóm nuôi thƣờng Nhóm nuôi béo
Ban đầu 17.93 ±1.12 18.09* ±1.31 Tuần 1 19.02 ±0.8 21.5* ± 1.22 Tuần 2 22.78 ±0.49 28.55* ±1.28 Tuần 3 26.16 ±0.56 36.23* ±1.52 Tuần 4 28.95 ±1.25 42.06* ±1.23 Tuần 5 31.12 ±1.81 46.25* ±1.42 Tuần 6 34.72 ±0.98 53.02* ± 1.15
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các lô chuột; (*): p < 0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường)
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dƣỡng khác nhau trong vòng 6 tuần
Các số liệu trong bảng 3.6 và hình 3.3 cho thấy chuột đƣợc nuôi theo chế độ ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về khối lƣợng lớn
17.93 19.02 22.78 26.16 28.95 31.12 34.72 18.09 21.5 28.55 36.23 42.06 46.25 53.02 0 10 20 30 40 50 60
Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6
Trọng lƣợng chuột (gam)
hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thƣờng và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05. Cụ thể: tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về khối lƣợng không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05). Sau 6 tuần nuôi, chuột nuôi bằng thức ăn thƣờng khối lƣợng cơ thể chỉ tăng thêm 16.79 g ứng với 93.64% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi bằng thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao khối lƣợng cơ thể tăng thêm 34.93 g ứng với 193.09% so với ban đầu. Nhƣ vậy, chuột ăn thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thƣờng là 18. 30 g hay gấp 2.08 lần.
Từ kết quả trên ta có thể đƣa ra kết luận ban đầu là chuột nuôi bằng thức ăn b o đã trở thành chuột béo phì về khối lƣợng cơ thể.
Để đánh giá ảnh hƣởng của chế độ nuôi b o đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột, vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4.
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm sau 6 tuần
Chỉ số (mmol/l) Nhóm nuôi thƣờng Nhóm nuôi béo So sánh lô béo/lô thƣờng TC 4.16 ± 0.24 5.56* ± 0.12 ↑1.34 lần TG 1.58 ± 0.2 2.35* ± 0.11 ↑1.49 lần HDL - c 1.52 ± 0.2 1.16* ± 0.12 ↓0.76 lần LDL - c 2.56 ± 0.22 3.65* ± 0.15 ↑1.43 lần Glucose 6.26 ± 0.11 8.12* ± 0.12 ↑1.30 lần
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của 10 con chuột; (*): p < 0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường; trong đó (↓) sự giảm,( ↑) sự tăng)
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm
Từ bảng số liệu bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự khác biệt rất lớn giữa nhóm nuôi thƣờng và nhóm nuôi béo. Cụ thể, ở nhóm chuột nuôi béo trong 6 tuần, hàm lƣợng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL – c trong huyết thanh đều tăng một cách có ý nghĩa (p<0.05) so với nhóm nuôi thƣờng.
Hàm lƣợng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL – c, glucose trong huyết thanh của nhóm chuột nuôi b o tăng tƣơng ứng gấp 1.34, 1.49, 1.43, 1.30 lần so với nhóm chuột nuôi thƣờng. Lý giải về kết quả này là do chuột đƣợc ăn thức ăn có thành phần giàu lipid (32%) và cholesterol (1%) nên các chỉ số cholesterol và triglycerid toàn phần trong máu tăng chủ yếu là do thu nhận từ quá trình tiêu hoá. Kết quả này là hoàn toàn phù hợp với quy luật thực tế và với nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự [16]. Điều đó chứng tỏ chuột ăn bằng thức ăn có hàm lƣợng lipid cao trong thời gian dài rất dễ bị rối loạn trao đổi lipid và glucid. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TC TG HDL - c LDL - c Glucose 4.16 1.58 1.52 2.56 6.26 5,56 2.35 1.16 3.65 8.12 mmol/l
Cholesterol là một hợp chất không thể thay thế, đóng vai trò trung tâm xây dựng màng tế bào, các mô thần kinh, hoocmon sinh dục, tiền chất để tổng hợp vitamin D và thúc đẩy quá trình tiêu hóa. Trong cơ thể, các cholesterol đƣợc tổng hợp tại các tế bào gan (chuyển hóa lipid nội sinh). Vì không tan trong nƣớc, nên để tuần hoàn đƣợc trong huyết tƣơng các lipid phải đƣợc kết hợp với các protein dƣới dạng phức hợp phân tử lớn gọi là lipoprotein. Có 6 loại lipoprotein khác nhau về thể khối, nhƣng có hai loại đƣợc quan tâm nhất là lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL – c) và lipoprotein tỷ trọng cao (HDL – c).
HDL – c chiếm khoảng 1/4 – 1/3 tổng số cholesterol trong máu. HDL – c đƣợc cho là loại mỡ tốt bởi vì nó chuyên trở các chất mỡ dƣ thừa từ tế bào ngoại vi về gan, sau đó đào thải qua mật và ngăn cản LDL – c bám vào thành động mạch gây tắc mạch. Ngoài ra, HDL – c cũng giúp hạn chế viêm nhiễm và bảo vệ các tế bào lót mặt trong của động mạch (nội mạc). Còn LDL – c đƣợc coi là mỡ xấu, vì nó vận chuyển cholesterol dƣ thừa tới bám vào thành động mạch làm nó hẹp lại, sau đó, kết hợp với các chất khác trong màng của thành động mạch tạo thành những mảng xơ vữa (atherosclerosis). Đây là nguyên nhân gây ra một số bệnh nguy hiểm nhƣ: nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não…
Triglycerid là thành phần chủ yếu của các lipoprotein khối lƣợng phân tử thấp (VLDL) và các chylomicron, nó đóng một vai trò quan trọng nhƣ là nguồn cung cấp năng lƣợng và chuyên chở các chất béo trong quá trình trao đổi chất. Triglyceride đƣợc tổng hợp và chuyển hoá qua lại ở gan và mô mỡ. Phần lớn (90%) lƣợng triglyceride trong máu đều do thức ăn mang lại. Sau một bữa ăn có nhiều chất béo, nồng độ triglyceride trong máu tăng cao. Khi không đƣợc tiêu dùng hết nó sẽ đƣợc dự trữ ở gan và mô mỡ. Điều này giải thích tại sao trong thời gian dài chuột ăn thức ăn giàu triglycerid lại có hàm lƣợng triglycerid trong máu cao. Khi hàm lƣợng triglyceride tăng sẽ làm gan nhiễm mỡ, đề kháng insulin dễ dẫn đến bệnh ĐTĐ. Nếu triglyceride quá cao (>1000mg/dl) có thể gây ra viêm ruột cấp.
Lô chuột béo có chỉ số cholesterol toàn phần tăng, triglyceride tăng, LDL – c tăng, HDL – c giảm chứng tỏ chuột đã bị rối loạn chuyển hóa lipid. Mặt khác, chỉ số glucose tăng 29.71% chứng tỏ là chuột đã bị rối loạn trao đổi glucid, lô chuột này đã có hiện tƣợng kháng insulin và nguy cơ chuột BP bị mắc ĐTĐ type 2 là rất cao.
Nhƣ vậy, từ các dẫn liệu về khối lƣợng cơ thể và các chỉ số hóa sinh của nhóm chuột nuôi béo có thể khẳng định mô hình chuột béo phì thực nghiệm đã thành công. Chuột b o phì đƣợc tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3. Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Với nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn b o trong thời gian dài (6 tuần) và tiêm màng bụng STZ (pha trong đệm Citrate 0.01M, pH 4.5) với liều đơn 110 mg/kg thể trọng, chúng tôi đã thành công trong việc gây ĐTĐ type 2 thực nghiệm. Các con chuột sau đó đƣợc tiến hành kiểm tra nồng độ glucose huyết thanh vào thời điểm trƣớc tiêm và sau tiêm 72 giờ.
Bảng 3.8. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trƣớc và sau khi tiêm STZ
Nhóm Các lô chuột Nồng độ glucose huyết (mmol/l) Trƣớc khi tiêm Sau khi tiêm 72 giờ
1 Chuột thƣờng tiêm đệm 6.89 ± 0.25 7.01 ± 0.35
2 Chuột thƣờng tiêm STZ 6.72 ± 0.31 7.02 ± 0.27
3 Chuột b o phì tiêm đệm 7.95 ± 0.35 8.19 ± 0.36
4 Chuột béo phì tiêm STZ 7.88 ± 0.32 22.32* ± 0.40 ↑2.83 lần
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của 5 con chuột; (*): p < 0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường;trong đó (↑) sự tăng)
Hình 3.5. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trƣớc và sau khi tiêm 72 giờ
Kết quả bảng 3.8 và hình 3.5 cho thấy:
Ở lô chuột thƣờng tiêm đệm hay tiêm STZ và lô chuột BP tiêm đệm thì nồng độ glucose huyết trƣớc và sau khi tiêm thay đổi không đáng kể và gần nhƣ ổn định.
Ở lô chuột BP tiêm STZ: sau khi tiêm 72h, nồng độ glucose huyết tăng cao so với ban đầu (glucose huyết tăng 14.44mmol/l so với ban đầu) và nồng độ glucose huyết đều trên 18mmol/l.
Nhƣ vậy việc kết hợp nuôi béo và tiêm STZ với liều đơn ở chuột và việc xây dựng mô hình chuột b o phì ĐTĐ mô phỏng theo ĐTĐ type 2 là thành công.
Từ đó ta cũng có thể khẳng định rằng rối loạn chuyển hóa lipid dễ dẫn tới rối loạn chuyển hóa glucid hay bệnh BP và bệnh ĐTĐ có mối quan hệ mật thiết với nhau. Kết quả đó phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả nhƣ: Đỗ Ngọc Liên và CS (2006) [7], Nguyễn Thị Hiền (2011) [2].
Hiện nay, có rất nhiều mô hình ĐTĐ mô phỏng type 2, nhƣ mô hình ĐTĐ di truyền, chuột thƣờng ĐTĐ, nhƣng mô hình chuột b o phì ĐTĐ vẫn đƣợc ƣa
0 5 10 15 20 25 Chuột thƣờng Chuột thƣờng tiêm STZ Chuột BP Chuột BP tiêm STZ 6.89 7.01 6.72 7.02 7.95 8.19 7.88 22.32 mmol/l
chuộng nhất bởi vì nó nhiều đặc điểm bệnh lý giống với ĐTĐ type 2 ở ngƣời [13]. Tuy nhiên, khả năng gây ĐTĐ type 2 ở chuột tuỳ thuộc nhiều yếu tố nhƣ dòng chuột lựa chọn, thời gian và chế độ nuôi béo, liều tiêm STZ. Nhiều công trình khác nhau công bố về hiệu quả mô hình này [9], [12], [13], [14].
3.4. Đánh giá tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề trên mô hình chuột BP thực nghiệm mô hình chuột BP thực nghiệm
3.4.1. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề lên khối lượng chuột béo phì thực nghiệm
Sau khi xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm thành công, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng giảm khối lƣợng chuột béo phì của các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề.
Chuột b o phì đƣợc uống các cao phân đoạn EtOH, cao phân đoạn n – hexan và cao phân đoạn CHCl3 với liều lƣợng 1500mg/kg thể trọng. Sau 3
tuần điều trị ta đƣợc kết quả sau:
Bảng 3.9. Khối lƣợng của các lô chuột b o phì trƣớc và sau 21 ngày điều trị bằng dịch chiết loài Mã Đề
Lô
Khối lƣợng (g) Trƣớc khi ĐT Sau 7 ngày
ĐT Sau 14 ngày ĐT Sau 21 ngày ĐT Không ĐT 53.47± 1.15 54.46± 0.21 55.71± 0.29 57.12± 0.38 EtOH 54.82± 1.17 4.65*±1.12 44.54*±1.31 41.05*±1.23 n – hexan 53.69± 1.04 48.45*±1.16 45.51*±1.15 42.12*±1.11 CHCl3 52.88± 1.23 48.41*±1.28 47.01*±1.35 45.91*±1.31
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của 5 con chuột/lô; (*): p<0.05 là giá trị có ý nghĩa thống kê của các lô chuột so sánh với lô chuột trước khi điều trị ở cùng thời điểm)
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh khối lƣợng của các lô chuột b o phì trƣớc và sau khi điều trị
Sau 21 ngày điều trị chúng tôi nhận thấy lô đối chứng chỉ cho uống nƣớc, không điều trị thì khối lƣợng tăng so trƣớc là 6.83%. Trong khi các lô chuột điều trị bằng các cao PĐ dịch chiết từ loài Mã Đề chỉ với hàm lƣợng 1500mg/kg thể trọng, khối lƣợng chuột đã giảm một cách đáng kể. Cụ thể nhƣ sau: có tác dụng mạnh nhất là ở cao phân đoạn EtOH (giảm 25.12%), cao phân đoạn n – hecxan (giảm 21.55%) và thấp nhất là cao CHCl3 (giảm 13.18%). Nhƣ vậy, tác dụng