2. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên
Cao các phân đoạn đƣợc hòa tan với từng loại dung môi thích hợp cho từng phản ứng định tính: thử định tính flavonoid, thử định tính với tannin và với alkanoid ... [5] [10]. Các nhóm phản ứng định tính đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các phản ứng định tính đặc trƣng Nhóm hợp
chất Phản ứng
Thuốc
thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCl
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dƣơng tính.
Dung dịch kiềm
NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric
H2SO4
10%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
Tannin
Vanilin/H2SO4
Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5% Gelatin/1% NaCl
Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dƣơng tính nếu kết tủa xuất hiện. Alkaloid Bouchardat Hỗn hợp KI + I2 /HCl
Phản ứng dƣơng tính nếu có màu đỏ thẫm.
VansMayer
Hỗn hợp HgCl2+
KI
Phản ứng dƣơng tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dƣơng tính nếu có kết tủa màu da cam.
Glycoside Keller – Killian
Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin – Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy
quang phổ UV VIS 1000 ở bƣớc sóng λ = 765nm, dùng chất chuẩn là acid gallic.
Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
Dung dịch gallic acid: 0.5g gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh. Nhƣ vậy dung dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nƣớc cất tới 1000ml.
Dung dịch mẫu cần định lƣợng.
Tiến hành xây dựng đường chuẩn gallic axid
Chuẩn bị cốc định lƣợng theo số lƣợng dung dịch gốc nhƣ sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10ml sau đó dẫn nƣớc cất tới 100ml ta thu đƣợc các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1.58ml H2O + 100µl thuốc thử Folin – Ciocalteau, sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300µl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bƣớc sóng 765nm.
Tiến hành định lƣợng acid gallic để dựng đƣờng chuẩn.
Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20µl (0.02ml) để định lƣợng tƣơng tự nhƣ đã làm với mẫu chuẩn acid gallic [2] [8].
2.2.3. Tạo mô hình chuột béo phì và chuột ĐTĐ thực nghiệm
2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết từ loài Mã Đề bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Lorke [15]. Chuột nhịn đói trƣớc 16h thí nghiệm đƣợc phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg (thể tích và khối lƣợng tối đa cho ph p) [7]. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ loài Mã Đề.
2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về đƣợc chăm sóc ở điều kiện bình thƣờng trong 3 – 4 ngày để thích ứng với môi trƣờng mới, sau đó, chúng tôi tiến hành phân chuột thành hai nhóm với hai chế độ dinh dƣỡng nhƣ sau:
Nhóm 1 – nhóm đối chứng: chuột đƣợc nuôi bằng thức ăn bình thƣờng (do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp)
Nhóm 2 – nhóm nuôi béo: chuột đƣợc nuôi theo chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol do chúng tôi phối trộn các thực phẩm dinh dƣỡng.
Các nhóm chuột đƣợc theo dõi trong vòng 6 tuần, khối lƣợng của các con chuột đƣợc kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định khối lƣợng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu. Các số liệu đƣợc thu thập và tiến hành xử lý thống kê.
2.2.3.3. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Để có mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 6 tuần đƣợc tiêm màng bụng liều đơn STZ (110mg/kg pha trong đệm Citrate 0.01M, pH = 4.5) [2] [10].
Đo đƣờng huyết tại các thời điểm 0 giờ (trƣớc khi tiêm STZ), 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sau khi tiêm STZ) (lần lƣợt thực hiện nhƣ vậy 3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tiếng và lấy giá trị trung bình). Chuột nào có đƣờng huyết cao (≥18 mmol/l) và ổn định đƣợc lựa chọn để cho uống cao các phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày.
2.2.4. Mô hình nghiên cứu tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề trên mô hình chuột BP thực nghiệm Mã Đề trên mô hình chuột BP thực nghiệm
Chuột b o phì đƣợc chia làm 4 lô (5 – 8con/lô).
Lô 1: uống nƣớc cất, không điều trị.
Lô 2, 3, 4: Chuột b o phì đƣợc uống các cao phân đoạn EtOH, n – hexan và cao phân đoạn CHCl với liều lƣợng 1500mg/kg thể trọng.
Sau 21 ngày điều trị, tiến hành xác định khối lƣợng và lấy máu chuột để phân tích một số chỉ số glucose, lipid máu. Máy xác định các thông số là tự động trên máy AV.400 OLYMPUS (Nhật Bản) tại bệnh viện Hữu nghị - Việt xô Hà Nội.
2.2.5. Thử khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề trên mô hình chuột ĐTĐ type 2
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) đƣợc ăn thức ăn thƣờng và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống các cao phân đoạn EtOH, n – hexan và cao phân đoạn CHCl3 với liều lƣợng 1500mg/kg thể trọng. Đƣờng huyết của các con chuột đƣợc đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trƣớc khi điều trị), ngày thứ 7, thứ 14, thứ 21 khi điều trị.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề
Để tìm hiểu thành phần hóa học của loài Mã Đề, chúng tôi tiến hành tách chiết các phân đoạn nhƣ đã mô tả ở phần phƣơng pháp nghiên cứu. Dƣới đây là quy trình tách chiết các phân đoạn:
Hình 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề (Plantago
major L.)
Cao PĐ CHCl3 (32.5g)
Loại dung môi Loại dung
môi Cao PĐ nƣớc (45.36g) Phân lớp CHCl3 Cao PĐ n – hexan (62.34g) Phân lớp nƣớc Phân lớp nƣớc Phân lớp n – hexan
Loại dung môi Chiết PĐ 3 lần
với CHCl3 (1:1)
Mã Đề (5000g)
Cao cồn tổng số (618g)
Để lại 20% (43.8g) cao cồn tổng số
Ngâm kiệt 3 lần với EtOH, lọc thu dịch chiết, cô loại dung môi
Hòa tan trong nƣớc, chiết PĐ 3 lần với n – hexan (1:1)
Với quy trình chiết rút nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc hiệu suất chiết rút các phân đoạn dịch chiết từ 5 kg loài Mã Đề nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề Phân đoạn Mẫu ban đầu (g) Hiệu suất chiết rút(%)*
Cao ethanol 218 4.36*
Cao n – hexan 62.34 1.25*
Cao chloroform 32.5 0.65*
(* Tính theo nguyên liệu khô ban đầu)
Nhƣ vậy, qua các dung môi có độ phân cực khác nhau đã thu đƣợc các cao phân đoạn dịch chiết khác nhau từ loài Mã Đề. Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở cao phân đoạn ethanol (4.36%) so với khối lƣợng khô ban đầu là 5000g, tiếp theo là cao phân đoạn n – hecxan (1.25%), và thấp nhất là cao phân đoạn chloroform (0.65%). Kết quả này bƣớc đầu cho thấy trong loài Mã Đề có chứa một lƣợng lớn các hợp chất tự nhiên. Để khẳng định chắc chắn điều này chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính và định lƣợng.
3.2. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần loài Mã Đề
3.2.1. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn
Để xác định các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề, chúng tôi đã sử dụng các thuốc thử đặc trƣng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên và thu đƣợc kết quả trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả thử định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề (Plantago major L.)
Nhóm chất Phản ứng đặc trƣng Phân đoạn EtOH n – hecxan CHCl3 Alkanoid Dragendroff +++ +++ - Bouchardat +++ ++ ++ Mayen ++ + - Flavonoid Shinoda +++ ++ + Diazo ++ + + H2SO4 đặc +++ ++ + NaOH 10% +++ ++ +
Glycoside Keller – killian +++ +++ ++
Polyphenol khác NaOH 10% +++ ++ + FeCl3 5% ++ + + Tanin Vanilin ++ + - Gelatin ++ + - Acetat chì +++ - + Chú thích: (-) : Không phản ứng (++) : Phản ứng mạnh (+) : Phản ứng (+++) : Phản ứng rất mạnh
Từ bảng 3.2 cho thấy: Cao phân đoạn ethanol phản ứng dƣơng tính với tất cả các thuốc thử, cao n – hecxan cũng phản ứng mạnh với hầu hết thuốc thử (trừ axetat chì) chứng tỏ thành phần chất tự nhiên trong cao ethanol, cao n – hexan rất đa dạng. Cao phân đoạn chloroform có mức độ phản ứng không mạnh bằng hai cao PĐ trên (không phản ứng với dragendroff, mayen, vanilin, gelatin). Từ đó có thể thấy rằng thành phần các hợp chất tự nhiên trong loài Mã Đề khá
phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến nhƣ: flavonoid, tannin, alkaloid và glycoside. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hƣớng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Kết quả định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid galilic
Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bƣớc sóng 765nm. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic TT Acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hình 3.2. Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic
y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) O D 7 6 5 n m
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol
Bảng 3.4. Định lƣợng polyphenol các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề (Plantago major L.)
Mẫu OD765nm Hàm lƣợng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ polyphenol (%) Cao EtOH 0.558 556.7 5.567 Cao n – hexan 0.215 202.2 2.022 Cao CHCl3 0.11 97.2 0.972
Kết quả bảng 3.4 cho thấy hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các cao phân đoạn là khá cao. Cao EtOH là cao nhất (5.567%) sau đó đến cao phân đoạn n – hexan (2.022%) và thấp nhất là cao phân đoạn CHCl3 (0.972%).
Kết quả đó chỉ ra rằng, trong loài Mã Đề có chứa nhiều hợp chất tự nhiên có khả năng tan tốt trong cao EtOH, cao n – hexan và cao CHCl3. Điều này hoàn toàn phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực. Polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học, theo nhiều nghiên cứu thì polyphenol có vai trò rất quan trọng trong điều trị bệnh BP và ĐTĐ, nên chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn EtOH, n – hexan, CHCl3 điều trị cho chuột BP và ĐTĐ.
3.3. Kết quả tạo mô hình chuột BP và chuột ĐTĐ type 2
3.3.1. Kết quả xác định liều độc cấp LD50
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ loài Mã Đề trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp của Lorke [15]. Chuột cho nhịn đói trƣớc 16 giờ thí nghiệm, đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và đƣợc cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết loài Mã Đề.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Liều cao nhất 8000 mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chƣa thể tính đƣợc LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ loài Mã Đề hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đƣờng uống.
3.3.2. Kết quả tạo mô hình chuột BP
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lƣợng ban đầu là 17 – 20g) đƣợc chia làm 8 lô.
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng).
Lô 2 – 8: Cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao.
Sau 6 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân khối lƣợng chuột. Kết quả sự thay đổi khối lƣợng của chuột thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Khối lƣợng trung bình (gam) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau
Nhóm
Tuần Nhóm nuôi thƣờng Nhóm nuôi béo
Ban đầu 17.93 ±1.12 18.09* ±1.31 Tuần 1 19.02 ±0.8 21.5* ± 1.22 Tuần 2 22.78 ±0.49 28.55* ±1.28 Tuần 3 26.16 ±0.56 36.23* ±1.52 Tuần 4 28.95 ±1.25 42.06* ±1.23 Tuần 5 31.12 ±1.81 46.25* ±1.42 Tuần 6 34.72 ±0.98 53.02* ± 1.15
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các lô chuột; (*): p < 0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường)
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dƣỡng khác nhau trong vòng 6 tuần
Các số liệu trong bảng 3.6 và hình 3.3 cho thấy chuột đƣợc nuôi theo chế độ ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về khối lƣợng lớn
17.93 19.02 22.78 26.16 28.95 31.12 34.72 18.09 21.5 28.55 36.23 42.06 46.25 53.02 0 10 20 30 40 50 60
Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6
Trọng lƣợng chuột (gam)
hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thƣờng và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05. Cụ thể: tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về khối lƣợng không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05). Sau 6 tuần nuôi, chuột nuôi bằng thức ăn thƣờng khối lƣợng cơ thể chỉ tăng thêm 16.79 g ứng với 93.64% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi bằng thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao khối lƣợng cơ thể tăng thêm 34.93 g ứng với 193.09% so với ban đầu. Nhƣ vậy, chuột ăn thức ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thƣờng là 18. 30 g hay gấp 2.08 lần.
Từ kết quả trên ta có thể đƣa ra kết luận ban đầu là chuột nuôi bằng thức ăn b o đã trở thành chuột béo phì về khối lƣợng cơ thể.
Để đánh giá ảnh hƣởng của chế độ nuôi b o đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột, vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4.
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm sau 6 tuần
Chỉ số (mmol/l) Nhóm nuôi thƣờng Nhóm nuôi béo So sánh lô béo/lô thƣờng TC 4.16 ± 0.24 5.56* ± 0.12 ↑1.34 lần TG 1.58 ± 0.2 2.35* ± 0.11 ↑1.49 lần HDL - c 1.52 ± 0.2 1.16* ± 0.12 ↓0.76 lần LDL - c 2.56 ± 0.22 3.65* ± 0.15 ↑1.43 lần Glucose 6.26 ± 0.11 8.12* ± 0.12 ↑1.30 lần
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của 10 con chuột; (*): p < 0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường; trong đó (↓) sự giảm,( ↑) sự tăng)
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm
Từ bảng số liệu bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự