tế bào ung thư MCF-7
Quy tắc phương pháp MTT
MTT là phương pháp so màu để đo hoạt động của enzyme làm biến đổi muối tetrazolium (MTT) có màu vàng, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl), 2,5- diphenyl tetrazolium bromide, thành formazan có màu tím, nhằm xác định số lượng tế bào sống trong các nghiên cứu về sự tăng trưởng và độc tính tế bào. Phương pháp dựa trên sự cắt đứt muối tetrazolium màu vàng (MTT) thành sản phẩm formazan màu xanh hòa tan bởi các enzyme trong ty thể. Lượng formazan tạo thành tỷ lệ với số tế bào sống hiện diện trong suốt quá trình tiếp xúc với MTT. Phương pháp MTT là phương pháp thực hiện nhanh, thuận tiện
và kinh tế nên nó là một phương pháp phổ biến để định lượng các tế bào sống trong nuôi cấy. Tuy nhiên, các thông số khác nhau được xác định có thể tác động đến sự biến dưỡng của tế bào và các yếu tố khác khiến hoạt động chuyên biệt của MTT biến đổi và làm sai lệch kết quả. Do đó, cần thiết lập các thông số để kiểm soát phù hợp cho mỗi dòng tế bào hoặc mỗi cách xử lý thuốc để tối ưu hóa điều kiện phân tích và giảm thiểu các tác động xấu. Các thông số này bao gồm: xác định mật độ tế bào thích hợp, môi trường nuôi cấy, nồng độ tối ưu và thời gian tiếp xúc với MTT, dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy, kiểm soát các tác động xử lý thuốc có thể ảnh hưởng đến sự biến dưỡng tế bào. Bằng cách kiểm soát những thông số quan trọng này, phương pháp MTT cung cấp số lượng tế bào ống chính xác và tin cậy.
Hình 2.9. Sự biến đổi của MTT dưới tác động của enzyme trong ty thể
Thực hiện:
Xây dựng đường cong tăng trưởng theo phương pháp MTT
Chọn Flask có mật độ tế bào cao, tách tế bào bằng Trypsin- EDTA 0,25%. Ly tâm và thu cặn tế bào.
Xác định mật độ tế bào trong dịch huyền phù bằng buồng đếm Neubauer.
Điều chỉnh mật độ tế bào của dịch huyền phù khoảng 104 tế bào/ ml và cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 100 µl. Cần đảm bảo huyền
phù thật đều để số lượng tế bào trong các giếng đều nhau. Đặt đĩa vào tủ nuôi 37°C, 5% CO2.
Sau 24h, thêm vào 10 µl MTT vào 3 giếng của từng ngày, ủ trong tủ nuôi. Sau 4h hút hết toàn bộ dung dịch có trong 3 giếng ra ngoài và thêm vào 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút.
Đo OD và thu số liệu trên máy đo OD DTX 880.
Thực hiện trong 8 ngày liên tiếp. Xây dựng đường cong tăng trưởng.
Khảo sát thuốc thử chuẩn Doxorubicin trên dòng tế bào MCF – 7
Thực hiện song song cùng thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng của dòng tế bào MCF - 7 là thí nghiệm khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF - 7.
Cũng như thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng, thì mật độ tế bào của dịch huyền phù cũng là 104 tế bào/ ml, mỗi giếng được cấy 100 µl dịch.
Đến ngày thứ 3 bắt đầu thay môi trường có bổ sung thuốc thử Doxorubicin với các nồng độ khác nhau 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125 µM vào lần lượt các giếng tương ứng, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Lúc này, mật độ tế bào có trong mỗi giếng sẽ khoảng 5 x 104 tế bào/ ml.
Thêm 10 µl MTT vào mỗi giếng cần đo, ủ trong tủ nuôi trong vòng 4h. Sau đó hút toàn bộ dịch có trong các giếng ra ngoài và thêm 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút.
Đo OD bằng máy đo DTX 880.
Đánh giá kết quả.
Thực hiện tạo dịch huyền phù tế bào có mật độ 5×104 tế bào/ ml.
Cấy vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng 100 µl dịch huyền phù tế bào, đặt đĩa vào tủ nuôi 37°C, 5% CO2 cho các tế bào ổn định.
Sau 24h thay môi trường cũ bằng môi trường mới chứa cao chiết theo nồng độ 100; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,125 μg/ μl môi trường nuôi.
Thêm 10µl MTT vào mỗi giếng cần đo, ủ trong tủ nuôi trong vòng 4h. Sau đó hút toàn bộ dịch có trong các giếng ra ngoài và thêm 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút.
Đo OD bằng máy đo DTX 880.
Đánh giá kết quả.